周偉娥,張?jiān)?,李偉青,李紹輝,蔣受軍,李紅娜,鄭陽(yáng),張峰
1(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 食品所,北京,100176)
2(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,廣西 南寧,530299)
3(廣西藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心,廣西南寧,530022)
隨著生活水平的提高,畜牧業(yè)的發(fā)展,獸藥的使用越來(lái)越廣泛。畜禽使用獸藥后,獸藥及其毒性代謝物易蓄積于動(dòng)物體內(nèi),并隨著食物鏈的傳遞,進(jìn)入人體,蓄積于體內(nèi)的獸藥殘留會(huì)威脅人類(lèi)健康,因此食品中獸藥殘留的問(wèn)題日益受到關(guān)注[1-2]。
大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素作為獸藥中重要一員,在臨床及獸藥領(lǐng)域均得到廣泛使用[3-5]。該類(lèi)藥物不可逆的結(jié)合到細(xì)菌核糖體50S亞基上,阻斷轉(zhuǎn)肽及mRNA位移,選擇性抑制蛋白質(zhì)合成,從而發(fā)揮抗菌作用[6]。該藥常用于治療上呼吸道感染、泌尿道感染和畜禽胃腸道感染等,少量使用能促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)[7-9]。但該藥毒副作用多見(jiàn),易造成胃腸道反應(yīng),肝腎損傷、耳蝸神經(jīng)受損、嚴(yán)重者可導(dǎo)致各種慢性中毒或“三致”等危害[10]。為保障食品安全,歐盟委員會(huì)和我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告都對(duì)食用性組織中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的最大殘留限量作出了規(guī)定,如表1示。因此,建立高效、簡(jiǎn)便的檢測(cè)分析方法以嚴(yán)格控制動(dòng)物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留是極其必要的。
截至目前,動(dòng)物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留檢測(cè)方法研究較多,本文綜述了國(guó)內(nèi)外近10年的動(dòng)物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留檢測(cè)技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn),擬為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)快速、簡(jiǎn)便、高通量方法提供依據(jù)。
目前在pudmed數(shù)據(jù)庫(kù)中,以macrolide為檢索詞,一共檢索出92 789篇,近5年約占20%,determination of macrolide為檢索詞,一共檢出29 690篇(約占總數(shù)的32%),近5年約占了22%,如圖1所示。而在中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)中,以大環(huán)內(nèi)酯為全文檢索,一共檢索出18 939篇,近5年約占47%,其中以大環(huán)內(nèi)酯殘留檢測(cè)為全文檢索,一共檢索出文獻(xiàn)1 411篇(約占總數(shù)的7.5%),近5年約占50%,如圖2所示??傮w來(lái)說(shuō),近10年國(guó)內(nèi)外對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的研究都有明顯的上升,近5年國(guó)內(nèi)外有關(guān)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物研究的文獻(xiàn)比例都較高,而近5年內(nèi)我國(guó)對(duì)于大環(huán)內(nèi)酯的殘留檢測(cè)研究比例比國(guó)外少得多,所以需要進(jìn)一步加大對(duì)食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的殘留檢測(cè)以保證食品安全,需要深入研究食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的殘留檢測(cè)技術(shù)。
表1 歐盟委員會(huì)(EC)和我國(guó)(CHA)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物在食用組織中的最大殘留限量規(guī)定Table 1 The maximum residue limit in edible tissue were regulated by European Commissio and China
圖1 Pudmed數(shù)據(jù)庫(kù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)情況Fig.1 Pudmed database literature statistics
圖2 中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)情況Fig.2 CNKI database literature statistics
大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物基本化學(xué)結(jié)構(gòu)是由14~16元大內(nèi)酯環(huán)與1~3個(gè)去氧氨基糖或者二甲氨基糖通過(guò)羥基縮合成的堿性苷。該藥多數(shù)為弱堿性親酯類(lèi)化合物,一般易溶于極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈等,微溶于水和弱極性溶劑[14]。該藥氨基糖結(jié)構(gòu)的叔胺基在酸性溶液中可離子化,使其在酸性溶液中有一定的溶解度,但其在強(qiáng)酸強(qiáng)堿中穩(wěn)定性較差。當(dāng)溶液pH <4.0時(shí),大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的糖苷鍵可能水解,當(dāng)溶液pH >9時(shí),內(nèi)酯環(huán)易開(kāi)裂,因此一般采用偏中性(pH 6~8)的極性有機(jī)溶液中溶解[15-16]。
大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素在各種動(dòng)物源性食品中均有殘留,如肉類(lèi)、內(nèi)臟、動(dòng)物奶及其制品、禽蛋和蜂蜜等[17-20]。樣品前處理是為了在各種復(fù)雜食品基質(zhì)中最大限度的提取、分離、凈化和富集藥物,以便于儀器檢測(cè)[21]。但由于食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的殘留水平較低,基質(zhì)復(fù)雜,干擾物質(zhì)多,加大了凈化的難度[22-23],所以需要尋找一個(gè)選擇性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、回收率高而穩(wěn)定的前處理方法,以解決食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留檢測(cè)問(wèn)題。目前,大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素前處理方法可分為傳統(tǒng)前處理方法和新型前處理方法。傳統(tǒng)前處理方法包括溶劑萃取或液液萃取等方式。新型技術(shù)前處理方法包括固相萃取、加壓液體萃取、中空纖維液相微萃取、基質(zhì)固相分散萃取等。前處理方法各有優(yōu)缺點(diǎn),需要根據(jù)研究的樣品性質(zhì)和待測(cè)物性質(zhì)選擇合適的前處理方法。
大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的傳統(tǒng)前處理方法是溶劑提取或液液萃?。?4-25]。溶劑提取一般過(guò)程是將樣品勻漿處理后,選擇極性有機(jī)溶劑萃取,在提取過(guò)程中,為了提高萃取效率,水浴、超聲、微波或振蕩等輔助措施均常被采用[26-27],如林潔等[28]采用體積分?jǐn)?shù)20%甲醇水溶液提取蜂蜜中的10種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素,用2 mmol/L乙酸銨水溶液調(diào)節(jié)溶液pH值,利用渦旋、超聲、水浴等輔助提取,回收率可達(dá)94% ~115%。甲醇和乙腈是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物最常用的提取溶劑[25,29]。劉曄等[30]在豬肝中比較了甲醇、乙腈、甲醇-水、甲醇-偏磷酸等提取溶液,發(fā)現(xiàn)甲醇對(duì)4種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的提取效率最高。蘇秀華等[31]在水產(chǎn)品中考察了乙腈、甲醇、酸化乙腈、偏磷酸-甲醇和乙酸乙酯等提取溶劑,發(fā)現(xiàn)乙腈對(duì)替米考星的提取效率最高。由于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素在酸性條件下有質(zhì)子化傾向,容易向水相轉(zhuǎn)移,有學(xué)者認(rèn)為酸化溶劑更有利于提取,張園等[32]在水產(chǎn)品中對(duì)比了甲醇、乙腈和1%的酸化乙腈溶液,認(rèn)為酸化乙腈溶液對(duì)泰樂(lè)菌素的提取效率最高。也有學(xué)者在堿性條件下提取[33-35],但回收率不理想,限制了其的使用,徐錦忠等[35]用NaCO3/NaHCO3緩沖液提取蜂蜜中8種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素,回收率達(dá)60% ~130%。
食品中多含有脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),因此在檢測(cè)前需要進(jìn)行除脂、沉淀蛋白等除雜過(guò)程[36-37],液液萃取是一種常見(jiàn)的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物凈化方式。液液萃取法主要基于被測(cè)物與雜質(zhì)在不同溶劑間的分配系數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)提取分離凈化。正己烷是常用的萃取溶劑之一[38-39]。張崇威等[40]采用 V(乙腈)∶V(水)=15∶2提取,正己烷液液萃取凈化,UPLC-MS/MS檢測(cè)豬肉、雞肉和雞蛋中7種獸藥殘留(包括3種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素),3種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的檢測(cè)限為0.5 μg/kg,回收率達(dá)80% ~100%。傳統(tǒng)前處理方法不需要特殊儀器設(shè)備,儀器成本低,操作簡(jiǎn)單,但是繁瑣費(fèi)時(shí),有機(jī)溶劑消耗量大,不利于安全環(huán)保,且共萃取雜質(zhì)較多,增加了凈化的工作量和難度。
3.2.1 固相萃取法(SPE法)
固相萃取(SPE)是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留檢測(cè)中最為常用的一種前處理方法[29-34]。其利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附,盡量少吸附或不吸附樣品基質(zhì)及干擾化合物,再通過(guò)洗脫液將目標(biāo)物洗脫收集而達(dá)到分離純化和富集的目的。根據(jù)固相萃取柱的作用機(jī)制可分為正相柱、反相柱、離子交換柱、吸附柱和混合柱如Bond Elut Plexa和Oasis HLB等。而大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素殘留樣品均可用上述5種固相萃取柱凈化[29-34],其中用的比較廣泛的是C18柱和HLB柱[41-42]。固相萃取法一般與溶劑萃取相結(jié)合運(yùn)用。Mi等[42]用體積分?jǐn)?shù)70%的乙腈溶液提取魚(yú)肉或蝦肉中7種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的殘留,并加入硅藻土吸附雜質(zhì),加入NaCl利于分層,還用正己烷除去脂肪后再用HLB柱凈化,回收率達(dá)68% ~85%。林維宣等[43]采用甲醇提取腸衣中7種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留量,水浴減壓濃縮后用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶,復(fù)溶液用固相萃取柱凈化,實(shí)驗(yàn)對(duì)比了 C18、Oasis(HLB)和MCX的凈化效果,結(jié)果顯示Oasis(HLB)回收率較理想,可達(dá)70.9% ~98.4%。該法操作簡(jiǎn)便,快速,減少不必要的工序,凈化效果比液液萃取提高很多,且便于自動(dòng)化。
3.2.2 加壓液體萃取(PLE)
加壓溶劑萃取通過(guò)提高萃取溫度和壓力,大大降低范德華力、氫鍵、偶極等作用,從而減弱基質(zhì)對(duì)分析成分的吸附作用,提高對(duì)分析成分的溶解能力。該方法具有萃取迅速、自動(dòng)化程度高,萃取劑使用較少,經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)勢(shì),在食品中大環(huán)內(nèi)酯殘留測(cè)定中多有應(yīng)用[44-46],如 Houda等[47]采用 PLE 法萃取魚(yú)和肉中 7種大環(huán)內(nèi)酯的殘留,回收率達(dá)77%以上,效果令人滿意。
3.2.3 中空纖維液相微萃取(HF-LPME)
HF-LPME是近年發(fā)展而來(lái)集采樣、萃取、濃縮于一體的前處理新技術(shù)。具有操作簡(jiǎn)便、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,可與GC和HPLC聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于藥物的檢測(cè)[47-48],此法也可應(yīng)用于食品中大環(huán)內(nèi)酯的殘留檢測(cè)。劉志梅等[49]用聚丙烯中空纖維在磁力攪拌器作用下對(duì)pH=8.5的牛奶樣品溶液進(jìn)行萃取,氮吹干后用乙腈溶解后色譜分析,3種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物回收率達(dá)79% ~105.3%,整個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)便、快速。但HFLPME應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留的相關(guān)研究較少,還有待進(jìn)一步的比較研究。
3.2.4 基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)(MSPDE)
基質(zhì)固相分散萃取(MSPDE)是在SPE的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)。其原理是試樣與SPE分散劑填料一起研磨混合均勻成半固態(tài)混合物,裝入空的SPE柱,再用溶劑淋洗除雜,然后收集含有待測(cè)組分的洗脫液,供檢測(cè)用。由于其凈化所需的樣品和溶劑量都較少,操作簡(jiǎn)便快捷,能與其他萃取方法相結(jié)合,在食品中大環(huán)內(nèi)酯藥物殘留檢測(cè)中有所應(yīng)用。Mayor等[50]采用MSPDE測(cè)定綿羊奶中7種大環(huán)內(nèi)酯藥物殘留,回收率達(dá)74%~97%。
3.2.5 其他前處理方法
支撐液膜萃取是一種新型萃取技術(shù),利用膜溶劑在惰性的多孔液膜支撐體上形成支撐液膜對(duì)樣品進(jìn)行分離和凈化。液膜可承受較大壓力,具有高選擇、高分離能力、高通量和有機(jī)溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)。Msagati等[51]在2004年首次利用支撐液膜萃取技術(shù)分離3種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物。除此之外,QuEChERS方法是集提取、分離、凈化于一體的方法,最初應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中,也逐漸應(yīng)用于獸藥殘留中[52],而在食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物應(yīng)用較少。目前,胡鳳楊等[53]利用QuECh-ERS技術(shù)處理蔬菜中的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物,回收率在51.6% ~98.7%。
在抗生素檢測(cè)中,微生物法屬于經(jīng)典的含量檢測(cè)方法。微生物法是根據(jù)抗生素對(duì)該藥敏感微生物的抑菌圈大小與抗生素濃度呈線性相關(guān)來(lái)定量檢測(cè)的。如黃曉蓉等[54]應(yīng)用微生物法篩查肉類(lèi)、水產(chǎn)品和蛋內(nèi)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。但是微生物法選擇不同的生產(chǎn)菌種,不同的生產(chǎn)廠家,易造成組分比例不同,使得微生物效價(jià)的測(cè)定差別加大,難以滿足準(zhǔn)確定性定量的要求,而逐漸被取代。
TLC法利用薄層板和各種有機(jī)溶劑在固液吸附色譜過(guò)程中將樣品組分分離和顯色,用薄層掃描法測(cè)定含量。該法可以通過(guò)變換不同的溶劑、顯色劑和檢測(cè)方式測(cè)定批量樣品,成本低,設(shè)備與操作簡(jiǎn)單。Petz等[55]用pH=8.5的乙腈水溶液提取動(dòng)物組織、奶、和蛋中的4種大環(huán)內(nèi)酯后用TLC分離鑒定。但是TLC法分離能力較差,對(duì)復(fù)雜樣品的的鑒定能力不足,靈敏度較低,不利于準(zhǔn)確定量分析而逐漸減少應(yīng)用。
紫外分光光度法是根據(jù)被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)內(nèi)有吸收,其吸光度與濃度成正比的定律,對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性定量。部分大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物如螺旋霉素、吉他霉素、替米考星等含有α,β-不飽和酮,在200~300 nm處有紫外吸收的光譜特征,可以應(yīng)用紫外分光光度法檢測(cè)。UV法儀器成本低,操作簡(jiǎn)單,如 Riedl等[56]用甲醇提取樣品中納他霉素,用UV法測(cè)定其含量。但是其檢測(cè)結(jié)果容易受樣品中雜質(zhì)的影響,對(duì)前處理的要求高,只適合檢測(cè)較純的物質(zhì),所以目前在大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)中沒(méi)能廣泛使用。
毛細(xì)管電泳(CE)是利用高壓電場(chǎng)在毛細(xì)管中將少量樣品進(jìn)行快速、高效分離分析,但檢測(cè)靈敏度較低,而電化學(xué)檢測(cè)靈敏度高,線性范圍寬,克服了CE的弱點(diǎn),兩者的結(jié)合能夠高分離能力高靈敏度的測(cè)定復(fù)雜樣品,因此在測(cè)定大環(huán)內(nèi)酯藥物中受到青睞[57-59],如史艷梅[60]采用 CE-ECL 測(cè)定牛奶中 3 種大環(huán)內(nèi)酯藥物,檢測(cè)限為3.2×10-7mol/L,但是多數(shù)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的氧化電位較高,易受到流動(dòng)相和樣品基質(zhì)中還原性物質(zhì)的干擾,因而電化學(xué)檢測(cè)器不易推廣。
氣相色譜法具有靈敏度高、專(zhuān)屬性好等特點(diǎn),適用于揮發(fā)性高、熱穩(wěn)定性較好、極性較高的化合物。若大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)要應(yīng)用GC法測(cè)定,需要將其衍生化,讓其適合GC定量檢測(cè),如Keigo等[61]將吉他霉素、螺旋霉素和泰樂(lè)菌素衍生化后用GC-MS測(cè)定其含量。尋找衍生化方法過(guò)程漫長(zhǎng)且衍生化步驟繁雜,所以無(wú)疑限制大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的GC法和GC-MS法的應(yīng)用。
高效液相色譜法是利用被測(cè)組分在2項(xiàng)中吸附或分配系數(shù)的微小差異而達(dá)到分離的目的,加上與紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器相結(jié)合,能夠同時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)大量的組分。該法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測(cè)速度快,線性范圍寬等特點(diǎn),同時(shí)能夠克服GC法缺點(diǎn),適合分析沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性較差、分子質(zhì)量大的化合物。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素大多難于氣化或衍生,且相當(dāng)一部分具有紫外吸收,所以該法廣泛應(yīng)用于食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留檢測(cè)。邢麗紅等[62]采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定鱸魚(yú)組織中阿維菌素、伊維菌素。Masakazu等[63]采用0.3%V(偏磷酸)∶V(甲醇溶液)=7∶3提取,ElutSCX(500 mg)固相萃取柱凈化,高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定肉中5種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留,檢測(cè)限可達(dá)0.05 μg/g,檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,但是還不能完全滿足低殘留的檢測(cè)需要。
與HPLC法相比,LC-MS的檢測(cè)器是質(zhì)譜檢測(cè)器。質(zhì)譜遵循帶電粒子磁場(chǎng)或電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)規(guī)律,利用化合物的質(zhì)荷比實(shí)現(xiàn)分離和利用豐度比實(shí)現(xiàn)定量,集高分離能力、高靈敏度、高分辨率于一體,是目前認(rèn)為最佳的分析方法用于動(dòng)物性食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的檢測(cè)[64-66]。Tao等[65]用 LC-MS 同時(shí)測(cè)定肉中17種大環(huán)內(nèi)酯藥物殘留,線性范圍在2~400 μg/kg之間,檢出限在0.55 μg/kg,回收率在75%以上。劉永濤等[27]用 LC-MS/MS測(cè)定水產(chǎn)品中5種大環(huán)內(nèi)酯,檢測(cè)限達(dá)1.0 μg/kg,在 1 ~ 100 μg/kg 的線性范圍,回收率達(dá)67.52% ~108.89%,分離與檢測(cè)都取得良好效果,適合食品中大環(huán)內(nèi)酯藥物殘留的痕量檢測(cè)。但是質(zhì)譜分析的儀器比較昂貴,對(duì)操作人員要求較高,在基層檢測(cè)中還有待進(jìn)一步推廣。
在過(guò)去的10年,無(wú)論是在畜禽還是水產(chǎn)等動(dòng)物源性食品中,大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物不同的前處理方法和檢測(cè)方法都相應(yīng)被開(kāi)發(fā)出,而研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)主要集中在前處理方法的開(kāi)發(fā)。但是截止到目前,動(dòng)物性食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素殘留檢測(cè)的前處理開(kāi)發(fā)的方法主要集中于SPE,而在其他獸藥殘留中常用的方法如固相微萃取技術(shù)、液相微萃取技術(shù)、QuEChERs方法等[67-69]在動(dòng)物性食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物中研究較少,有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。目前,分析檢測(cè)研究趨勢(shì)是向高分離度、高準(zhǔn)確度、高靈敏度、高分辨率發(fā)展,食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留檢測(cè)也主要應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜或軌道阱質(zhì)譜儀具有較強(qiáng)大的多殘留篩查能力,有待進(jìn)一步的應(yīng)用。處理裝置小,處理速度快,操作簡(jiǎn)單化,樣品和有機(jī)溶劑用量少,對(duì)待測(cè)成分的選擇性和回收率高,易于自動(dòng)化的前處理方法與高分離度、高準(zhǔn)確度、高靈敏度、高分辨率的分析儀器的相結(jié)合應(yīng)用必將得到更大的發(fā)展,以滿足獸藥殘留檢測(cè)的需要。
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