齊玲倩，劉秀，丁夢(mèng)璇，李靜媛，劉遠(yuǎn)遠(yuǎn)，尹建軍

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

果汁是一種重要的飲品，但如今果汁摻假問(wèn)題日趨嚴(yán)重，如市場(chǎng)上存在著橙汁摻加柑橘汁、西柚汁、胡柚汁，蘋(píng)果汁摻加梨汁、白葡萄汁，紅色漿果汁摻加蘋(píng)果汁及相互摻加等問(wèn)題［1-2］。這損害了消費(fèi)者的利益，阻礙了果汁行業(yè)的發(fā)展和國(guó)際貿(mào)易的進(jìn)行，因此，果汁中水果成分的檢測(cè)顯得尤為重要。

分子生物學(xué)技術(shù)具有方便、準(zhǔn)確、迅速、簡(jiǎn)潔的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確無(wú)誤地從基因水平分析果汁的品種和來(lái)源，其結(jié)果為證明果汁的真?zhèn)翁峁┝丝煽康囊罁?jù)。目前，分子生物學(xué)方法在中草藥鑒定、肉類(lèi)鑒別上均有應(yīng)用，在果汁鑒偽領(lǐng)域亦有廣闊的發(fā)展空間［1，3-4］。然而，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行果汁鑒偽的關(guān)鍵是高質(zhì)量DNA提取方法的建立。由于果汁富含多糖、多酚、單寧、色素及一些次生代謝物質(zhì)，使得DNA提取困難，如多酚類(lèi)物質(zhì)能使DNA氧化成棕褐色凝膠狀物，多糖類(lèi)物質(zhì)能與DNA結(jié)合成黏稠的膠狀物［5-7］。目前，常見(jiàn)的果汁DNA提取方法有CTAB法、改良試劑盒法、改良 CTAB 法等［8-10］。李富威等［11-12］應(yīng)用天根試劑盒提取木瓜汁、香蕉汁及食品中的DNA，建立了食品中木瓜和香蕉成分的基因檢測(cè)方法，韓建勛等［13］使用改良CTAB法提取梨汁、蘋(píng)果汁中的DNA，建立了果汁中梨成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，但是，沈夏艷等［14］采用改良試劑盒法提取的澄清蘋(píng)果汁DNA濃度較低，且果肉型蘋(píng)果汁提取純度也不高，Chang-Chai Ng等［15］采用改良CTAB方法可以提取鮮榨橙汁DNA，但不適合提取果汁飲料等的DNA。雖然從果汁中提取DNA的研究較多，但大部分集中在單一或較少種類(lèi)的果汁上，且有效性不高，而關(guān)于多種果汁的高效通用DNA提取方法研究較少。

本文以匯源100%蘋(píng)果汁等7種渾濁果汁和百森紅蘋(píng)果汁等6種澄清果汁為研究對(duì)象，對(duì)比CTAB法、試劑盒法、改良CTAB法提取果汁DNA的濃度、純度及PCR擴(kuò)增效率，以期獲得高效通用的果汁DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

果實(shí)樣品1種，桃;渾濁果汁樣品7種，包括鮮果粒蘋(píng)果汁(A)、匯源100%桃汁(B)、匯源山楂汁(C)、蘭芝藍(lán)莓原漿(D)、鮮果粒橙汁(E)、茹夢(mèng)芒果汁(F)、匯源100%梨汁(G);澄清果汁樣品6種，包括百森紅蘋(píng)果汁(a)、匯源冰糖葫蘆(b)、青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c)、康師傅鮮果橙(d)、匯源100%葡萄汁(e)、梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f)，均購(gòu)于北京超市。

1.2 試劑

DNA提取試劑:CTAB裂解液(20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol/L Na2EDTA，pH=8)，CTAB 沉淀液(5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl)，STE 核分離液(700 mmol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L EDTA，20 g/L PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)，pH=8)，CTAB核裂解液(20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.05 mol/L EDTA，20 g/L PVP-40，pH=8)，1.2 mol/L NaCl溶液，3.2 mol/L NaCl溶液(pH=5.2)，Tirs飽和酚/三氯甲烷(體積比25∶24)，三氯甲烷/異戊醇(體積比24∶1)。其他試劑或溶劑均為分析純級(jí)或生化純級(jí)。

DP305植物基因組提取試劑盒:天根生化科技有限公司;PCR擴(kuò)增采用的 Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs，購(gòu)于北京全式金生物有限公司;RNaseA，DNA Marker DL 2 000;PCR擴(kuò)增引物，由英濰捷基(上海)生物有限公司合成。

1.3 主要儀器與設(shè)備

微量移液器，德國(guó) Eppendorf公司;離心機(jī)(5804R型，5424型)，德國(guó) Eppendorf公司;超微量核酸蛋白分析儀(Biodrop)，英國(guó)柏點(diǎn)公司;普通PCR擴(kuò)增儀，英國(guó)BIOMETRA公司;電泳儀(JY-300C)，北京君意儀器公司;凝膠成像儀，法國(guó)VILBER公司。

1.4 DNA提取方法

1.4.1 CTAB 法［16］

對(duì)于濁汁，取30 mL果汁于50 mL離心管中，8 679 r/min離心10 min，棄上清液;加入5 mL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，振蕩混勻，65℃溫浴1 h，期間混勻幾次;8 679 r/min離心15 min，將1 mL上清液移至新的2 mL離心管中，加入700 μL的三氯甲烷，振蕩均勻，11 684 r/min離心10 min;吸取650 μL上清液移至2 mL離心管中，加入1.3 mL CTAB沉淀液，劇烈混勻，室溫靜置1 h;11 684 r/min離心10 min;加入350 μL NaCl(1.2 mol/L)溶液，劇烈振蕩，再加入350 μL三濾甲烷，劇烈振蕩，11 684 r/min離心10 min，吸取上清移至新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，-20℃靜置30 min;11 684 r/min離心20 min，棄上清液，加入500 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀，11 684 r/min離心20 min;棄上清，將離心管倒置于超凈工作臺(tái)上10～15 min，吹干沉淀;用50 μL無(wú)菌超純水溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)于清汁，取30 mL果汁至潔凈培養(yǎng)皿中，真空干燥至剩余1 mL液體(若不足，加無(wú)菌超純水補(bǔ)足)，將液體轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入5 mL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，振蕩混勻，65℃溫浴1 h，期間混勻幾次;其余步驟同濁汁。

1.4.2 試劑盒法

對(duì)于濁汁，取果汁1 mL裝入2 mL離心管中，加入700～800 μL緩沖液GP1，渦旋振蕩30 s。隨后按照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒的步驟對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。

對(duì)于清汁，取30 mL果汁至潔凈培養(yǎng)皿中，真空干燥至剩余1 mL液體(若不足，加超純水補(bǔ)足)，將液體轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，加入700～800 μL緩沖液GP1，渦旋振蕩30 s。隨后按照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒的步驟對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。

1.4.3 改良CTAB法

對(duì)于濁汁，取果汁1 mL于2 mL離心管中，加入1 mL異丙醇，混勻，-20℃靜置30 min，12 000 r/min，4 ℃，離心10 min，棄上清，在沉淀中加入600 μL STE核分離液，混勻，4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，在沉淀中加入700 μL CTAB核裂解液，14 μL β-巰基乙醇，混勻，65℃溫浴1 h，期間不時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管幾次，取出后，加入等體積Tirs飽和酚/三氯甲烷，振蕩混勻，靜置5 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇，振蕩混勻，靜置5 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，加入1/10體積3.2 mol/L NaCl，等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20℃靜置1 h，4℃，12 000 r/min離心15～20 min，棄上清，70%乙醇洗沉淀2次，倒置晾干后加入50 μL無(wú)菌超純水，混勻，-20℃保存。

對(duì)于清汁，取30 mL果汁于50 mL離心管中，11 000 r/min，4 ℃，離心 10 min，棄上清;向沉淀中加入3 mL STE核分離液，混勻，分2次轉(zhuǎn)入2 mL離心管，4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，在沉淀中加入 700 μLCTAB 核裂解液，14 μL β-巰基乙醇，混勻，65℃溫浴1 h，期間不時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管幾次，其余步驟同濁汁。

1.5 DNA提取質(zhì)量的測(cè)定

取DNA溶液1 μL，用超微量核酸蛋白分析儀(Biodrop)測(cè)定以上3種方法提取的DNA在光波260 nm和280 nm處的紫外吸收值，通過(guò)OD260/OD280和濃度值判斷DNA的純度和濃度，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次。

用通用引物18SrDNA基因?qū)μ崛〉臉悠稤NA進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證提取的果汁DNA分子是否適合于PCR分析，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為137 bp。

引物序列為:

18S rDNA-F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA;

18S rDNA-R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT。

擴(kuò)增體系:DNA模板2 μL;10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL;dNTPs(10 mmol/l)2 μL;上、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL;Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)0.25 μL，用無(wú)菌水補(bǔ)至總體積為25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 果汁DNA提取效率的比較

2.1.1 渾濁果汁DNA提取效率比較

用CTAB法、試劑盒法法以及改良CTAB法提取7 種渾濁果汁飲料(A、B、C、D、E、F、G)的基因組，用Biodrop超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定以上3種方法提取的DNA的純度和濃度，結(jié)果列于表1。

用超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定在260 nm和280 nm處的紫外吸收值分別代表核酸、蛋白質(zhì)等有機(jī)物的吸光度值。對(duì)于高質(zhì)量的DNA樣品，OD260/OD280應(yīng)在1.8左右。當(dāng) OD260/OD280小于1.8時(shí)，說(shuō)明DNA中存在蛋白質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)的污染;反之，說(shuō)明DNA樣品存在RNA或小分子核酸污染。從表1數(shù)據(jù)可以看出，除茹夢(mèng)芒果汁(F)外，試劑盒法(天根植物基因組提取試劑盒)在其余渾濁果汁飲料的核酸提取上，效果不理想。CTAB法在提取鮮果粒橙汁(E)、茹夢(mèng)芒果汁(F)DNA時(shí)，濃度較高，但純度較差，而在其他果汁樣品DNA提取時(shí)，濃度較低。改良CTAB法提取的DNA樣品的OD260/OD280，相對(duì)另2種方法更接近1.8，且DNA濃度更高，說(shuō)明使用改良CTAB法更適合提取渾濁果汁DNA，其中，應(yīng)用改良CTAB法提取蘭芝藍(lán)莓原漿(D)的DNA時(shí)，濃度較低，可能是由于藍(lán)莓中花青素含量過(guò)多，影響了核酸的釋放。

表1 不同方法提取的渾濁果汁DNA濃度和純度的比較(a±SD，n=3)Table 1 Comparison of purity and concentration of DNA extracted from juice nectar by different methods(a±SD，n=3)

2.1.2 澄清果汁DNA提取效率的比較

用CTAB法、試劑盒法以及改良CTAB法提取6種澄清果汁飲料(a，b，c，d，e，f)的基因組，用 Biodrop超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定以上3種方法提取的DNA的純度和濃度，結(jié)果列于表2。

從表2數(shù)據(jù)可以看出，試劑盒法(天根植物基因組提取試劑盒)無(wú)法提取到6種澄清果汁飲料中的核酸。CTAB法提取的青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c)和康師傅鮮果橙(e)DNA，濃度相對(duì)較高，但純度較差，而提取的其他澄清果汁樣品DNA，濃度較低，純度也較差，且無(wú)法提取到匯源100%葡萄汁(e)的DNA。改良CTAB法提取的澄清果汁的 DNA，濃度相對(duì)更高，OD260/OD280相對(duì)更接近1.8，說(shuō)明改良CTAB法是較為合適的澄清果汁DNA提取方法。其中，應(yīng)用改良CTAB法提取百森紅蘋(píng)果汁(a)和梨工場(chǎng)梨汁(f)的DNA時(shí)，濃度較低，可能是由于多酚類(lèi)物質(zhì)氧化物的存在，影響了核酸的釋放。

表2 不同方法提取的澄清果汁DNA濃度和純度的比較(a±SD，n=3)Table 2 Comparison of purity and concentration of DNA extracted from clarified fruit juice by different methods(a±SD，n=3)

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以桃果肉DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，細(xì)菌DNA作為陰性對(duì)照，用通用引物18Sr DNA基因?qū)TAB法、試劑盒法和改良CTAB法提取的7種渾濁果汁飲料和6種澄清果汁飲料的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

對(duì)比圖1～圖3可知，相對(duì)于CTAB法和試劑盒法，改良CTAB法提取的渾濁果汁DNA樣品，均可擴(kuò)增出18SrDNA基因的對(duì)應(yīng)條帶，且條帶較為清晰、明亮，但3號(hào)、4號(hào)條帶相對(duì)較暗，這可能是匯源山楂汁(C)和蘭芝藍(lán)莓原漿(D)相對(duì)較低的DNA濃度導(dǎo)致的;同時(shí)，3種方法中，只有改良CTAB法提取的澄清果汁DNA樣品，對(duì)18Sr DNA基因的137 bp大小的目的片段均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，但由于澄清果汁DNA含量普遍較低，故擴(kuò)增出的目的條帶較陽(yáng)性條帶暗。

綜上，改良CTAB法提取的渾濁果汁和澄清果汁基因組DNA均可用于后續(xù)的PCR檢測(cè)研究。

圖1 CTAB法提取的果汁基因組18SrDNA基因PCR電泳檢測(cè)圖譜注:1.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;2.陽(yáng)性對(duì)照:桃;3.匯源100%蘋(píng)果汁(A);4.匯源100%桃汁(B);5.匯源山楂汁(C);6.蘭芝藍(lán)莓原漿(D);7.鮮果粒橙汁(E);8.茹夢(mèng)芒果汁(F);9.匯源100%梨汁(G);10.陰性對(duì)照:細(xì)菌;11、12.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);13.百森紅蘋(píng)果汁(a);14.匯源冰糖葫蘆(b);15.青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c);16.康師傅鮮果橙(d);17.匯源100%葡萄汁(e);18.梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f);19.陽(yáng)性對(duì)照:桃;20.陰性對(duì)照:細(xì)菌;21.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水。Fig.1 Electrophoresis profile of PCR productsof 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the CTAB method

圖2 試劑盒法提取的果汁基因組18SrDNA基因PCR電泳檢測(cè)圖譜注:1.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);2.匯源100%蘋(píng)果汁(A);3.匯源100%桃汁(B);4.匯源山楂汁(C);5.蘭芝藍(lán)莓原漿(D);6.鮮果粒橙汁(E);7.茹夢(mèng)芒果汁(F);8.匯源100%梨汁(G);9.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;10.陰性對(duì)照:細(xì)菌;11.陽(yáng)性對(duì)照:桃;12.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);13.百森紅蘋(píng)果汁(a);14.匯源冰糖葫蘆(b);15.青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c);16.康師傅鮮果橙(d);17.匯源100%葡萄汁(e);18.梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f);19.陽(yáng)性對(duì)照:桃;20.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水。Fig.2 Electrophoresis profile of PCR products amplifiedby 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the DNA extraction kit method

圖3 改良CTAB法提取的果汁基因組18SrDNA基因PCR電泳檢測(cè)圖譜注:M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);1.匯源100%蘋(píng)果汁(A);2.匯源100%桃汁(B);3.匯源山楂汁(C);4.蘭芝藍(lán)莓原漿(D);5.鮮果粒橙汁(E);6.茹夢(mèng)芒果汁(F);7.匯源100%梨汁(G);8.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;9.陽(yáng)性對(duì)照:桃;10.陰性對(duì)照:細(xì)菌;11.M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);12.百森紅蘋(píng)果汁(a);13.匯源冰糖葫蘆(b);14.青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c);15.康師傅鮮果橙(d);16.匯源100%葡萄汁(e);17.梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f);18.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;19.陽(yáng)性對(duì)照:桃;20.陰性對(duì)照:細(xì)菌。Fig.3 Electrophoresis profile of PCR products amplifiedby 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the modified CTAB method

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采取3種DNA提取方案從渾濁果汁和澄清果汁中提取DNA，通過(guò)比較DNA的純度、濃度，檢驗(yàn)DNA的PCR擴(kuò)增效率，確定了提取效率較高的方法-改良CTAB法，該方法從前處理方法、裂解液成分和異丙醇沉淀時(shí)間等方面對(duì)DNA提取方法存在的問(wèn)題進(jìn)行了改進(jìn)。首先，考慮到果汁中DNA含量相對(duì)較少，故對(duì)渾濁果汁采用異丙醇沉淀的方法對(duì)DNA進(jìn)行富集，對(duì)澄清果汁采取離心濃縮的方法進(jìn)行富集，簡(jiǎn)單易行，且提高了DNA的得率。其次，果汁樣品受次生代謝物質(zhì)的影響，致使DNA有限釋放，故在果汁樣品裂解前，預(yù)加核分離液去除部分多糖、多酚、色素等雜質(zhì)，方便有效。再次，為抑制果汁中的多酚氧化并與DNA結(jié)合造成的褐變，在裂解液(700 μL)中加入20g/L PVP-40與體積分?jǐn)?shù)2%β-巰基乙醇，從而提高樣品DNA的質(zhì)量以及PCR擴(kuò)增效率。最后，異丙醇沉淀時(shí)間對(duì)DNA純度有重要影響［17］，沉淀時(shí)間越長(zhǎng)，DNA濃度越高但純度越低，考慮到果汁DNA的濃度、純度以及提取過(guò)程的時(shí)耗，選擇在-20℃下沉淀1 h。

最終建立的渾濁果汁和澄清果汁DNA的有效提取方法，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間，提高了DNA的提取效率，可為以后的果汁真實(shí)性基因檢測(cè)提供參考。

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