唐柯，王蓓，馬玥，徐巖，李記明

1(食品科學與技術(shù)國家重點實驗室、工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室、江南大學生物工程學院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇無錫，214122)2(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東煙臺，264000)

有機酸是葡萄酒中重要的組成成分之一，葡萄酒中的有機酸主要來源于葡萄果實(蘋果酸、酒石酸、檸檬酸)以及發(fā)酵過程(乳酸、乙酸、琥珀酸)［1］。有機酸是葡萄酒中重要的呈味物質(zhì)，是葡萄酒酸度的主要決定因素。有機酸的種類、含量和比例調(diào)節(jié)著葡萄酒的酸堿平衡，影響著葡萄酒的口感、色澤及生物穩(wěn)定性［2］。

冰葡萄酒是采用特殊釀造工藝釀造的葡萄酒。它是將葡萄推遲采收，在-8℃的氣溫下，果實掛在枝頭通過自然結(jié)冰和風干，葡萄中的糖分得到高度濃縮，在結(jié)冰的狀態(tài)下壓榨、低溫保糖發(fā)酵釀制而成的甜型葡萄酒(VQA，1999)。釀造冰酒的過程十分緩慢，經(jīng)常要花費數(shù)個月才能達到期望的酒精含量。在如此長時間發(fā)酵期內(nèi)，保持其發(fā)酵安全性和品質(zhì)的優(yōu)異，口感的協(xié)調(diào)至關(guān)重要，因此冰酒發(fā)酵對酵母和發(fā)酵溫度的選擇具有特殊性。酵母種類對冰酒發(fā)酵過程中乙酸和甘油形成、發(fā)酵速度和冰酒的感官特性有顯著的影響［3］。由于冰葡萄汁的含糖量高，黏度大，高糖引起的高滲透脅迫會產(chǎn)生一定量的乙酸，而使酒的揮發(fā)酸含量高于一般的葡萄酒［4］。因此，冰酒發(fā)酵過程的重點是保持果香，形成優(yōu)雅的酒香和醇和的口感，控制揮發(fā)酸的含量。主要措施就是選擇適宜的酵母菌和控制發(fā)酵溫度。加拿大科學家在冰酒發(fā)酵過程中選擇了7個商品酵母進行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵母ST、N96和EC1118對香氣和乙酸的控制最好，適合釀造冰酒［5］。Pigeau等研究了含糖量高于40°Brix的冰葡萄汁對酵母發(fā)酵的影響，結(jié)果表明隨著冰葡萄汁含糖量的增加，發(fā)酵過程中產(chǎn)生了更多的乙酸和甘油，并且酵母生長速率和乙醇生成量都有所降低［6］。邵威平的研究發(fā)現(xiàn)，冰葡萄酒發(fā)酵溫度為5℃時，酵母活性受到很大抑制;當發(fā)酵溫度高于10℃時，隨著溫度的升高，發(fā)酵原酒的酒度和揮發(fā)酸明顯增高，總糖、干浸出物和氨基酸含量減少，削弱了冰酒甜潤醇厚的典型性［7］。

我國作為世界上僅有的幾個能釀造冰葡萄酒的國家，冰酒資源優(yōu)勢非常明顯。但是目前國內(nèi)對冰葡萄酒的研究仍相對較少，而且當前的研究更多的集中于冰葡萄酒的釀造工藝及香氣分析［8-10］，對于冰葡萄酒品質(zhì)具有重要影響的有機酸的系統(tǒng)研究還尚未見報道。本文以不同釀造條件的冰葡萄酒為研究對象，通過高效液相色譜分析不同酵母不同發(fā)酵溫度對冰葡萄酒有機酸含量的影響，為進一步改進冰葡萄酒釀造工藝，提高我國冰葡萄酒品質(zhì)提供科學參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料:選用遼寧省桓仁地區(qū)產(chǎn)2011年份威代爾葡萄，采收時糖度為32°Brix。

酵母:EC、R2、K1、ST，白香郁均由張裕葡萄酒公司提供。

試劑:草酸、酒石酸、甲酸、丙酮酸、L-蘋果酸、莽草酸、L-抗壞血酸、L-乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸等12種有機酸標樣購自Sigma-Aldrich公司，純度均在99%以上。

1.2 儀器與設備

pH計，METTLER TOLEDO;恒溫烘箱，上海實驗儀器廠有限公司;循環(huán)水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市子華儀器有限責任公司;純水儀，Millipore Simplicity UV Bedford，MA，USA;安捷倫液相色譜儀1200配有紫外檢測器，美國安捷倫公司。

1.3 標準溶液的配制

分別精確稱取草酸等12種有機酸0.2～0.8 g，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移置10 mL棕色容量瓶中，用流動相定容至刻度，封口，作為標準貯備液，在-20℃保存?zhèn)溆?。使用前，根?jù)實驗需要將此標準貯備液用流動相稀釋至適宜含量，以配制標準工作液和混合標準工作液。

1.4 色譜條件

參照段云濤(2007)的方法［14］，略有改動。WATERS Atlantis T3色譜柱(4.6 mm×150 mm ID，3 μm);保護柱為 PhenomeneX RP-C18Security Guard(4.0 mm×3.0 mm)，紫外檢測波長為210 nm，柱溫30℃，進樣量為10 μL，以峰面積外標法定量。

等度洗脫:流動相為:10 mmol/L NaH2PO4，pH 2.7;流速為0.8 mL/min。

冰葡萄酒樣品與流動相按照1∶9(v/v)進行稀釋，測定前經(jīng)0.45 μm水相微孔濾膜過濾。

1.5 試驗方法

分別在10，15，20 ℃三個溫度下，接種 EC、R2、K1、ST和白香郁5種釀酒酵母進行發(fā)酵，酵母接種量統(tǒng)一為1×106個細胞/mL，發(fā)酵工藝參照文獻［8］。發(fā)酵設備采用50 L不銹鋼發(fā)酵罐，每個處理各發(fā)兩罐。3個溫度下5種釀酒酵母發(fā)酵的冰葡萄原酒的理化指標數(shù)據(jù)見表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0分析軟件進行，繪圖采用SigmaPlot 12.1進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性

將酒石酸、琥珀酸、乙酸、丙酮酸、草酸、L-蘋果酸、L-乳酸、檸檬酸、L-抗壞血酸、甲酸、莽草酸和馬來酸共計12種標準品配成混合樣品，用增高法定性。結(jié)果表明，12種有機酸標準品在上述色譜條件下，能夠充分分離，并且峰型銳利，分離效果較好(見圖1)。

表1 不同處理條件發(fā)酵的威代爾冰葡萄原酒的理化指標Table 1 Characteristics of Vidal ice wine produced by different fermentation conditions

圖1 12種有機酸標樣色譜圖(a)及冰酒樣品色譜圖(b)Fig.1 Chromatogram of twelve organic acids from a standard mixture(a)and an icewine sample(b)by HPLC

2.2 不同釀造方式對冰葡萄酒總有機酸含量的影響

對不同酵母及不同發(fā)酵溫度發(fā)酵的冰葡萄酒樣品中12種有機酸含量的測定結(jié)果見表2。從表2中可以看出，在所有冰酒樣品中均檢測到了除甲酸及抗壞血酸外的10種有機酸。在這10種有機酸中，蘋果酸的含量最高，約占總有機酸的50%左右，其次乙酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸的含量也較高。馬來酸的含量最低，平均只有0.002 g/L左右。從總量上來看，20℃ R2酵母發(fā)酵的冰葡萄酒有機酸含量最高，達到14.515 g/L，而EC在10℃下發(fā)酵的含量最低，只有12.472 g/L。

酒石酸、蘋果酸與檸檬酸是葡萄果實中自然形成的3種有機酸，也是葡萄酒中的3種固有酸;琥珀酸，乳酸，乙酸則是來自于發(fā)酵過程。通常，在葡萄酒中主要的有機酸類物質(zhì)是酒石酸、蘋果酸與檸檬酸［11］。Kritsunankul等人研究發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量的葡萄酒往往含有較高來自葡萄果實的有機酸，而含有較低發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸［12］。從表2中可以，在不同酵母、不同溫度下發(fā)酵的冰酒樣品中酒石酸、蘋果酸與檸檬酸的含量均較高。此外，因為發(fā)酵后的冰酒樣品均未經(jīng)過蘋果酸-乳酸發(fā)酵，所以蘋果酸在冰酒有機酸的含量很高，占到了總有機酸的50%左右，而乳酸的含量則非常低。影響葡萄果實中蘋果酸含量最主要的因素是氣候，較冷環(huán)境收獲的葡萄果實中蘋果酸含量更高［13］。冰葡萄后熟期環(huán)境溫度較低，因此冰葡萄中蘋果酸含量比普通葡萄果實更高。段云濤等人的研究中，3款來自加拿大的冰酒中蘋果酸的含量范圍為4.873～5.192 g/L，本實驗蘋果酸含量范圍為6.225～6.855 g/L，略高于其檢測值［14］。

琥珀酸是葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種重要的有機酸，琥珀酸的味感復雜，既酸又苦，也是葡萄酒所含有機酸類中最富于味覺反應的一種酸。根據(jù)Castellari等人的研究，耐冷凍沉淀、非耐冷凍沉淀酵母發(fā)酵葡萄酒中琥珀酸含量分別為1.090 g/L、0.530 g/L，可以看出不同酵母發(fā)酵會導致琥珀酸含量有較大差異［15］。Aragon等對不同釀造溫度葡萄酒有機酸含量變化展開研究，葡萄酒琥珀酸含量范圍為1.03～1.33 g/L，其含量變化與發(fā)酵溫度沒有明顯聯(lián)系［16］。從本研究中結(jié)果看，琥珀酸含量與發(fā)酵溫度也無明顯聯(lián)系。

表2 不同處理條件發(fā)酵的威代爾冰葡萄原酒中有機酸含量 (n=3) 單位:g/LTable 2 The content of organic acids in Vidal ice wine produced by different fermentation conditions(n=3)

2.2.1 不同酵母對冰酒有機酸含量的影響

從圖2中可以看出，在10℃的發(fā)酵溫度下，EC、K1和ST產(chǎn)生的有機酸含量較低，白香郁有機酸含量最高;在15℃的發(fā)酵溫度下，同樣是ST產(chǎn)生的有機酸含量最低，EC和K1含量較高，兩者之間并無顯著性差異;在20℃的發(fā)酵溫度下，ST與白香郁的有機酸含量較低，而R2有機酸含量最高。綜合來看，ST在3個溫度下產(chǎn)生的有機酸含量在5個酵母中都相對較低。

2.2.2 不同發(fā)酵溫度對冰酒有機酸含量的影響

圖3是不同發(fā)酵溫度發(fā)酵冰葡萄酒的總有機酸含量。從圖3中可以看出，5種酵母在3個不同發(fā)酵溫度下對有機酸的影響不完全相同。在用EC1118、R2、K1、ST四種酵母釀造的冰酒中，總有機酸含量隨溫度升高而增加。而白香郁酵母釀造冰酒總有機酸含量的變化趨勢則與其他4種酵母有所不同，其釀造溫度為10℃時，總有機酸含量最高。綜合來看，較低的溫度有利于控制有機酸含量的生成。

圖2 不同酵母發(fā)酵冰葡萄酒有機酸含量Fig.2 The content of organic acids fermented with different species of yeast strains

圖3 不同發(fā)酵溫度發(fā)酵冰葡萄酒有機酸含量Fig.3 The content of organic acids fermented with different temperature

2.3 不同釀造方式對冰葡萄酒乙酸含量的影響

從表2可以看出，在不同溫度不同酵母發(fā)酵的15個冰酒樣品中，乙酸含量最高的是20℃ R2酵母發(fā)酵的冰酒樣品，達到2.488 g/L;最低的是10℃下ST酵母發(fā)酵的冰酒樣品，乙酸含量只有1.316 g/L。此外，在不同發(fā)酵溫度下乙酸與總有機酸含量變化趨勢基本一致，釀造溫度越高，乙酸含量越高，較低的發(fā)酵溫度有利于對乙酸的控制;而不同酵母發(fā)酵的冰酒樣品中，ST對乙酸的控制最好，乙酸生成量最低。

乙酸是葡萄酒釀造過程的“晴雨表”，其含量的高低直接影響到葡萄酒的品質(zhì)。由于冰葡萄汁的高糖濃度作用于酵母細胞壁后，會形成過高的滲透壓，使酵母代謝異常，一方面使得發(fā)酵過程通常要達到數(shù)月才可以達到期望的酒精度，另一方面高糖導致的高滲透壓會形成大量的揮發(fā)酸，其中最主要是乙酸［4］。較低濃度的乙酸對冰酒質(zhì)量不會產(chǎn)生很大影響，乙酸在乙醇乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下和乙醇生成乙酸乙酯，它會給葡萄酒帶來一定的果香味，但是高濃度的乙酸會對葡萄酒的風味產(chǎn)生較大影響。在加拿大，VQA(1999)關(guān)于冰酒中揮發(fā)酸的限定是最高不超過2.1 g/L。而Cliff等的研究發(fā)現(xiàn)，冰酒中乙酸的閾值是3.185 g/L，通常絕大多數(shù)冰酒中的乙酸含量都不會超過這個值［17］。最近一項對于加拿大冰酒的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在加拿大冰酒中乙酸含量范圍很大，在0.49～2.29 g/L之間，但是平均水平在1.3 g/L左右，還是遠遠低于冰酒中乙酸的感覺閾值，不會對冰酒的風味帶來較大影響［18］。表2結(jié)果可以看出，在3個溫度、5個酵母發(fā)酵的15款冰酒樣品中，檢測到的乙酸在1.316～2.488 g/L之間，同樣遠低于3.185 g/L的閾值水平。

2.4 雙因素方差分析

為了進一步考察發(fā)酵溫度及酵母與乙酸含量之間的關(guān)系，我們通過雙因素方差分析對其進行判斷。表3是各主體間效應檢驗表及方差分析表，從各項顯著性檢驗的P值來看，截距上溫度與酵母對乙酸含量的影響，在0.05的顯著性水平上是非常顯著的，說明無論發(fā)酵溫度還是不同的酵母對冰酒發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸都有很大的影響。

表3 主體間效應的檢驗表及方差分析表Table 3 Tests of between-subjects effects

表4是不同溫度對乙酸含量多重比較的結(jié)果，從顯著性檢驗的結(jié)果來看，3個發(fā)酵溫度兩兩之間都是具有顯著差異的，說明3個不同的發(fā)酵溫度之間乙酸含量差異很大。

表4 不同溫度對乙酸含量多重比較結(jié)果Table 4 Themultiple comparisons of different temperature

表5是不同酵母對乙酸含量的多重比較結(jié)果，從分局顯著性檢驗的結(jié)果來看，在不同酵母發(fā)酵冰酒產(chǎn)生乙醇含量之間，除了酵母EC與R2，EC與K1差異不顯著外，剩余不同酵母之間差異都是極顯著的。

表5 不同酵母對乙酸含量多重比較結(jié)果Table 5 Themultiple comparisons of different yeast strains

3 結(jié)論

本文采用HPLC分析技術(shù)測定了不同溫度不同酵母釀造的威代爾冰葡萄酒中12種主要的有機酸，結(jié)果表明，在所有冰葡萄酒樣品中均檢測到了除甲酸和抗壞血酸外的10種有機酸，其中蘋果酸含量最高，酒石酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸的含量也比較高，其他有機酸含量基本都小于1 g/L，馬來酸含量最低，平均只有0.002 g/L?？傆袡C酸含量隨釀造溫度升高而增加。較低的發(fā)酵溫度有利于對乙酸的控制。ST酵母在不同發(fā)酵溫度下乙酸含量均較低。

通過雙因素方差分析的統(tǒng)計學方法，對不同酵母不同溫度下發(fā)酵的15款冰葡萄酒中的乙酸含量進行分析。結(jié)果表明，無論發(fā)酵溫度還是酵母種類對冰酒發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸都有極顯著地影響;3個不同的發(fā)酵溫度之間乙酸含量差異很大;在不同酵母發(fā)酵冰酒產(chǎn)生乙酸含量之間，除了酵母EC與R2，EC與K1差異不顯著外，剩余不同酵母之間差異都是極顯著的。

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