高夫超

（黑龍江省農(nóng)科院牡丹江分院，157041）

利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析長白山中華蜜蜂遺傳多樣性

高夫超

（黑龍江省農(nóng)科院牡丹江分院，157041）

利用21對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)吉林長白山中華蜜蜂群體遺傳多樣性進(jìn)行分析，共檢測(cè)到39個(gè)等位基因，等位基因數(shù)目從1～5不等。平均等位基因數(shù)為1.8571；所有位點(diǎn)的平均期望雜合度（He）和平均多態(tài)信息含量（PIC）值分別為0.2068和0.1679。表明長白山中華蜜蜂群體遺傳多樣性較低。

中華蜜蜂；微衛(wèi)星；遺傳多樣性

中華蜜蜂(Apis cerana cerana)是我國特有的蜜蜂遺傳資源，公認(rèn)它有5個(gè)生態(tài)型[1]。長白山中蜂屬于其中的東北生態(tài)型，主要分布在長白山區(qū)東部的高海拔區(qū)和中、西部低海拔淺山地帶，歷經(jīng)數(shù)千年的繁盛時(shí)期，長白山中蜂有其獨(dú)特的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)和生產(chǎn)性狀，一直以來都是本地蜂業(yè)生產(chǎn)中的佼佼者，深受廣大養(yǎng)蜂愛好者的青睞[2]。

遺傳多樣性(genetic diversity)一般指品種內(nèi)個(gè)體在DNA水平上的千差萬別。通過對(duì)遺傳多樣性的研究，可了解品種的遺傳結(jié)構(gòu)、生活背景，分析其進(jìn)化的歷史和潛力，以及探討品種瀕危的原因和現(xiàn)狀，提出合理的保種措施[3]。微衛(wèi)星標(biāo)記作為一種有效的評(píng)價(jià)動(dòng)物遺傳資源的分子標(biāo)記，具有分布廣泛、多態(tài)信息含量高、呈共顯性遺傳及檢測(cè)快速方便等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被成功地用于畜禽遺傳變異及品種間遺傳關(guān)系的研究，同時(shí)在構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、評(píng)價(jià)遺傳多樣性和群體進(jìn)化、繪制系統(tǒng)發(fā)生樹、血緣關(guān)系鑒定、核基因組研究以及基因定位等研究中得到廣泛的應(yīng)用[4-5]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先推薦的遺傳資源分析工具[6]。目前微衛(wèi)星標(biāo)記分析已經(jīng)成為群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性研究中最普遍最有效的手段之一，但關(guān)于中蜂(Apis cerana cerana)微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性的研究還相對(duì)較少。本試驗(yàn)采用21對(duì)微衛(wèi)星引物從DNA水平上分析長白山中蜂群體遺傳多樣性，評(píng)估其群體遺傳結(jié)構(gòu)，以期能夠?yàn)檎_評(píng)價(jià)和合理保護(hù)利用其遺傳資源提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣本采集于吉林長白山地區(qū)，共30群。DNA提取參照吉挺[7]所建立的方法。提取的DNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記的選擇

21對(duì)微衛(wèi)星引物信息列于表1，引物序列參考NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)等網(wǎng)站和Michel Solignac等[8]報(bào)導(dǎo)。

表1 21個(gè)微衛(wèi)星座位的位置和單個(gè)引物的PCR反應(yīng)條件

1.2.2 PCR反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系共20 μL：50 ng/μL DNA模板1 μL，10×buffer 2.0 μL，25 mmo1/L MgCl21.6～2.2 μL(因基因座而異)，10 mmol/μL的dNTP 0.5 μL，10 pmo1/μL的引物各1μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，用超純水補(bǔ)足20 μL。

擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性50 s，50～60℃復(fù)性50 s，72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

1.2.3 基因型判定

特異的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，用銀染法顯影、定影。Kodak成像系統(tǒng)拍照保存圖片。利用Kodak Digital Science ID Image Analysis Software根據(jù)PBR322/Msp I Marker為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算擴(kuò)增片段的大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

利用Microsatellite-Toolkit軟件[9]計(jì)算等位基因頻率與期望雜合度。根據(jù)Botstein等[10]的公式計(jì)算每一個(gè)群體每一個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量。

n為等位基因數(shù)，pi為第i個(gè)等位基因的基因頻率，pj為第j個(gè)等位基因的基因頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 長白山中蜂21個(gè)微衛(wèi)星擴(kuò)增結(jié)果

用21對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)長白山中蜂群體基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見表2。結(jié)果顯示共檢測(cè)到144個(gè)等位基因。單個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)從2（A024d、A035）到12（AC011）不等，平均為5.76。At003位點(diǎn)則擁有最高的期望雜合度和PIC值，為0.8881和0.8604。

2.2 長白山中蜂21個(gè)微衛(wèi)星座位等位基因頻率

根據(jù)各位點(diǎn)不同基因型數(shù)目計(jì)算出長白山中蜂21個(gè)微衛(wèi)星座位的等位基因頻率，結(jié)果見表3。

3 討論

本研究21個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分布于中蜂的14條染色體上，覆蓋了中蜂基因組85%以上的染色體，因此能夠較好地反映長白山中蜂的遺傳多樣性，具有較高的可信性。

等位基因數(shù)量反映了某個(gè)基因座在進(jìn)化過程中所積累的遺傳變異，等位基因數(shù)量越多說明進(jìn)化歷史上這個(gè)基因座突變?cè)交钴S，導(dǎo)致物種在自然選擇中發(fā)展的取向越多，對(duì)生活環(huán)境適應(yīng)的潛能越大。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，長白山中蜂21個(gè)微衛(wèi)星座位中共檢測(cè)到39個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為1.8571個(gè)，最高為5個(gè)，最低為1個(gè)，表明這些微衛(wèi)星座位多態(tài)性較低。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因片段多態(tài)性較好的指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該座位為高度多態(tài)性座位；0.25＜PIC＜0.5時(shí)，為中度多態(tài)性座位；PIC＜0.25時(shí)，為低度多態(tài)性座位[11]。同時(shí)多態(tài)信息含量關(guān)系到該座位可用性及使用效率，多態(tài)信息含量越大，在一個(gè)群體中，該座位雜合子比例則越大，提供的遺傳信息就越高。本研究中有1個(gè)位點(diǎn)處于高度多態(tài)，6個(gè)位點(diǎn)屬于中度多態(tài)性位點(diǎn)，4個(gè)位點(diǎn)屬于低度多態(tài)性位點(diǎn)，10個(gè)位點(diǎn)無多態(tài)性，平均PIC值為0.1679，說明這21個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在長白山中蜂群體中所提供的多態(tài)信息含量較低，用以分析其遺傳多樣性具有較高的有效性和可靠性。

基因雜合度也稱為基因多樣度，一般認(rèn)為它是度量群體遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)，其值越大說明群體遺傳變異越大，反之，則越小。澤格.歐特將多態(tài)位點(diǎn)定義為雜合度至少為0.10的位點(diǎn)[12]，本研究所分析的21個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中，11個(gè)位點(diǎn)均有較高的多態(tài)性（均高于0.10），占52.38%，10個(gè)位點(diǎn)為0，占47.62%。群體遺傳多樣性較低，選擇潛力較低，今后可將它們作為候選遺傳標(biāo)記用于性狀和標(biāo)記間的連鎖分析，并對(duì)種質(zhì)保存提供參考。平均基因雜合度大小近似的反映出遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低。吉挺等[13]使用8對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)江蘇省中華蜜蜂進(jìn)行遺傳多樣性研究，宜興中蜂的8個(gè)位點(diǎn)的期望雜合度為0.4424，本研究中長白山中蜂21個(gè)微衛(wèi)星座位的平均基因雜合度為0.2068，低于宜興中蜂，顯示出較低的遺傳多樣性和選擇潛力。

表2 長白山中蜂21個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因數(shù)、等位基因大小、平均期望雜合度、多態(tài)信息含量

表3 各位點(diǎn)等位基因頻率

本研究結(jié)果表明，長白山中蜂的群體遺傳變異較小，多態(tài)信息含量較低，說明其近交程度較高。但在對(duì)其進(jìn)行品種進(jìn)行長期保存時(shí)，需要保持一定的規(guī)模，并運(yùn)用有效的保種措施，如建立自然保護(hù)區(qū)等，保護(hù)種質(zhì)基因資源，防止有利基因的丟失。

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Study on Genetic Diversity of Apis cerana cerana Populations from Changbai Mountain by Microsatellite Makers

Gao Fuchao
（Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agriculture Science,157041 China）

Genetic diversity of Apis cerana cerana Populations from Changbai Mountain in Jilin province was evaluated with 21 microstaellite makers.The results showed that,39 alleles were found in 21 microstaellite loci,the number of alleles per locus ranged from 1 to 5,mean number of effective alleles was 1.8571,the average expected heterozygosity and PIC of all loci were 0.2068 and 0.1679,respectively.These results indicated that the Apis cerana cerana populations from Changbai Mountain had low level of genetic diversity.

Apis cerana cerana;microsatellite markers;genetic diversity

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-45-SYZ5）

高夫超，男（1965-），副研究員，主要從事蜂學(xué)方面的研究。E-mail:mdjgfc@126.com.