，， ，

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)研究生院)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

Kiss-1高表達(dá)抑制結(jié)腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響

劉迪群1*，溫彩玲2，鐘華1，周偉偉1

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)研究生院)

目的探討Kiss-1高表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響，初步明確Kiss-1基因?qū)|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和MMP-2表達(dá)的影響。方法用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將質(zhì)粒pEGFP-N1-Kiss-1及pEGFP-N1空載體質(zhì)粒瞬時(shí)導(dǎo)入結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，細(xì)胞隨機(jī)分三組：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力、Western-blot和Real-time PCR分別從蛋白和mRNA水平檢測(cè)Kiss-1表達(dá)對(duì)MMP-9、MMP-2表達(dá)的影響。結(jié)果成功將pEGFP-N1-Kiss-1重組質(zhì)粒瞬時(shí)導(dǎo)入結(jié)腸癌SW480細(xì)胞。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出實(shí)驗(yàn)組較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組能明顯降低SW480細(xì)胞侵襲能力的作用(P<0.05)。Western blot和Real-time PCR檢測(cè)出實(shí)驗(yàn)組Kiss-1 蛋白和mRNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組或空白對(duì)照組顯著增加，而實(shí)驗(yàn)組MMP-9、MMP-2蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Kiss-1抑制MMP-9和MMP-2的表達(dá)，其調(diào)控機(jī)制可能與抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。

結(jié)腸癌SW480細(xì)胞； Kiss-1； MMP-9； MMP-2； 侵襲； 轉(zhuǎn)移

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)腸癌患者死亡率位居惡性腫瘤第2位[1]。近年我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前結(jié)腸癌的主要治療方法是外科手術(shù)，但仍有40%～50%的結(jié)腸癌患者術(shù)后會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移與蛋白酶有關(guān)，特別是腫瘤細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，其中MMP-9和MMP-2尤為重要[3]。Kiss-1基因被確定為人類一種新的轉(zhuǎn)移抑制基因，通過(guò)顯微細(xì)胞介導(dǎo)將人類6號(hào)染色體轉(zhuǎn)移到人黑色素瘤細(xì)胞株C8161，其Kiss-1表達(dá)能顯著抑制在裸鼠中成瘤的轉(zhuǎn)移能力[4]。因此，本研究旨在體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Kiss-1高表達(dá)的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，擬探討Kiss-1高表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響，初步明確Kiss-1對(duì)MMP-9、MMP-2的表達(dá)影響，為結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料結(jié)腸癌SW480細(xì)胞保存于南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床研究所-80 ℃冰箱中；質(zhì)粒pEGFP-N1-Kiss-1及空載體(pEGFP-N1)質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P公司合成，均含有綠色熒光蛋白(GFP)，經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM 2000購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；鼠抗人Kiss-1購(gòu)自Millipore公司(原裝進(jìn)口)；鼠抗人β-actin購(gòu)自北京中杉金橋生物公司(國(guó)產(chǎn))，兔抗人MMP-9和MMP-2 購(gòu)自武漢博士得公司(國(guó)產(chǎn))；總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程公司，RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR Master Mix購(gòu)自BIONEER公司；引物均由上海生工生物公司合成，經(jīng)DNA質(zhì)譜檢測(cè)無(wú)誤。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組將結(jié)腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)于10%新生牛血清的1 640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%以上融合度時(shí)將其隨機(jī)分為三組：空白對(duì)照組：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組；陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體細(xì)胞組；實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1-Kiss-1細(xì)胞組。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞[5]，以3×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪于6孔板培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用無(wú)血清1 640培養(yǎng)基將3.2 μg pEGFP-N1-Kiss-1質(zhì)粒和8 μL Lipofectamine2000分別稀釋至總體積為250 μL，室溫下靜置5 min，按照以上組合制備 lipofectamineTM2000- pEGFP-N1-Kiss-1混合物，在室溫下孵育 20 min后，將混合物加入6孔板細(xì)胞中，用無(wú)血清1 640培養(yǎng)基定容至2 mL，在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵化6 h后更換含10%新生牛血清的1 640培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，確定轉(zhuǎn)染效率。陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染方法同實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染效率=(發(fā)出綠色熒光細(xì)胞數(shù)/可見(jiàn)光下的總細(xì)胞數(shù)) ×100%。

1.3.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將有基質(zhì)膠的transwell小室(Corning，美國(guó)，8.0 μm孔徑)置入無(wú)菌的 24 孔培養(yǎng)板中。再取已做好轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞，用無(wú)血清1 640培養(yǎng)基懸浮、計(jì)數(shù)，稀釋至密度為 1×106/mL，每個(gè)上室中分別加入200 μL細(xì)胞懸液，24 孔板每個(gè)下室加入 600 μL含有 30%新生牛血清的1 640培養(yǎng)基。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)48 h后棄去孔中舊培養(yǎng)液，PBS清洗 2 遍，用4%甲醛500 μL/孔加入下室進(jìn)行固定30 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，再用1%結(jié)晶紫500 μL染色20 min，用清水洗3遍以上，最后在400倍顯微鏡下隨機(jī)觀察五個(gè)視野并計(jì)每個(gè)視野內(nèi)穿透小室微孔膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均侵襲細(xì)胞數(shù)和侵襲抑制率。侵襲抑制率(IR)的公式為：IR(%)=(空白對(duì)照組穿膜數(shù)-實(shí)驗(yàn)組穿膜數(shù))/對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.3 Real-time PCR Kiss-1、MMP-9、MMP-2和GADPH引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。按照總RNA提取試劑盒操作步驟提取已做好轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)其吸光度(OD260/OD280)值和濃度；按AccuPower?RocketScriptTM RT MasterMix試劑盒，將總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為：引物退火 37 ℃ 1 min；CDNA合成(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)) 42 ℃ 60 min；滅活(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)) 95 ℃ 5 min；最后將cDNA按2X GreenstarTM qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性，95 ℃ 5 min；PCR反應(yīng)，95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，51個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后采用溶解曲線確定產(chǎn)物特異性，以2-△△CT值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GADPH作為內(nèi)參；△△CT =實(shí)驗(yàn)組目的基因的△CT值-陰性對(duì)照組目的基因的△CT值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1Kiss-1、MMP-9、MMP-2和GADPH的引物序列

名稱引物序列(5'→3')Kiss-1F:CACCCTCTGGACATTCACCR:CAGTAGCTGCCAAGAAACCAMMP-9F:CAGTCCACCCTTGTGCTCTTR:ACTCTCCACGCATCTCTGCMMP-2F:AGTTTCCATTCCGCTTCCAGR:CGGTCGTAGTCCTCAGTGGTGADPHF:AGAAGGCTGGGGCTCATTTGR:AGGGGCCATCCACAGTCTTC

1.3.4 Western-blot 分別提取已做好轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中SW480細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定各組樣本蛋白濃度，用10%和15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(poly vinylidene fluoride,PVDF膜)后，用5%封閉液(TBST中含5%脫脂奶)室溫封閉2 h，再依次孵育對(duì)應(yīng)一抗及二抗，最后利用凝膠成像系統(tǒng)(配備有軟件BIO-ID)采集圖像，采用AlphaImager2200凝膠圖像系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行灰度值掃描，最后采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行制圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,分別檢測(cè)Kiss-1、MMP-9和MMP-2蛋白的表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法應(yīng)用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較兩組間的差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pEGFP-N1-Kiss-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率pEGFP-N1-Kiss-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上(圖1)。

圖1 pEGFP-N1-Kiss-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞48h后綠色熒光蛋白的表達(dá)(400×) A：正常；B：熒光

2.2 Transwell檢測(cè)Kiss-1對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲的影響三組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)(14.50±3.88)顯著低于陰性對(duì)照組(19.22±4.87)及空白對(duì)照組(21.12±5.12)SW480細(xì)胞侵襲數(shù)(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組侵襲抑制率顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。Kiss-1能明顯降低結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的侵襲能力。

表2Transwell檢測(cè)Kiss-1對(duì)三組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲的影響(n=3)

組別細(xì)胞侵襲數(shù)(個(gè))侵襲抑制率(%)空白對(duì)照組21.12±5.120.00陰性對(duì)照組19.22±4.877.75±1.18實(shí)驗(yàn)組14.50±3.88ac24.38±6.25a

與陰性對(duì)照組比較，a：P<0.05；與空白對(duì)照組比較，c：P<0.05

圖2 Transwell檢測(cè)Kiss-1對(duì)三組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲的影響 與陰性對(duì)照組比較，a：P<0.05；與空白對(duì)照組比較，c：P<0.05

2.3 Real-time PCR檢測(cè)Kiss-1、 MMP-9和MMP-2在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中mRNA相對(duì)表達(dá)量陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Kiss-1、 MMP-9和MMP-2mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)組中Kiss-1mRNA高表達(dá)，而MMP-9和MMP-2mRNA的表達(dá)水平顯著降低，兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Kiss-1高表達(dá)可抑制MMP-9、MMP-2的表達(dá)。

2.4 Western-blot檢測(cè)Kiss-1、 MMP-9和MMP-2在SW480細(xì)胞中蛋白的表達(dá)三組SW480細(xì)胞中Kiss-1、 MMP-9和MMP-2蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示： Kiss-1蛋白在實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)，而在陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組中低表達(dá)，三組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MMP-9和MMP-2蛋白在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)和空白對(duì)照組(P<0.05)。Kiss-1高表達(dá)可抑制MMP-9、MMP-2的表達(dá)。

圖3 Real-time PCR檢測(cè)Kiss-1、 MMP-9和MMP-2在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中mRNA相對(duì)表達(dá)量 與陰性對(duì)照組比較，*：P<0.05

3 討 論

絕大多數(shù)中晚期腫瘤患者預(yù)后與是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟過(guò)程并涉及復(fù)雜的腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞間的相互作用[6]。當(dāng)腫瘤發(fā)生發(fā)展時(shí)可激活MMP-9和MMP-2形成IV型膠原、V型膠原和明膠 ，在細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解和再塑造中發(fā)揮重要作用，并可使腫瘤細(xì)胞沿著缺失的基底膜向周圍組織產(chǎn)生浸潤(rùn)，從而引起腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。因此，越來(lái)越多的研究熱點(diǎn)是如何抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤的進(jìn)展。早有研究發(fā)現(xiàn)，在多種已發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤中Kiss-1呈低表達(dá)，如胃癌、乳腺癌、鼻咽癌[5，7-8]，這表明Kiss-1作為轉(zhuǎn)移抑制基因及其受體的缺失可能與人類腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。目前Kiss-1基因的抑制機(jī)制至今尚未清楚。早有報(bào)道說(shuō)Kiss-1基因抑制轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與細(xì)胞外調(diào)控ERK磷酸化及誘導(dǎo)胞質(zhì)IkBα降解胞漿中p65/p60含量，進(jìn)而使MMP-2和MMP-9表達(dá)減少有關(guān)[9-10]。而最近Ji等[11]在大腸癌中研究發(fā)現(xiàn)Kiss-1通過(guò)抑制ERK磷酸化途徑而不是JNK途徑，最終促使NF-kB降解使MMP-9活性下降，這將對(duì)于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移具有重大作用。除此之外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)報(bào)道Kiss-1可明顯抑制大腸癌HT115細(xì)胞系的侵襲和遷移能力，并且臨床隊(duì)列研究的初步數(shù)據(jù)也支持這一論點(diǎn)。同時(shí)也不乏學(xué)者研究大腸癌組織中發(fā)現(xiàn)Kiss-1甲基化和蛋白表達(dá)對(duì)于診斷和判斷預(yù)后有重要意義[11]。本次研究發(fā)現(xiàn)Kiss-1可顯著降低結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的侵襲能力，關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Kiss-1與MMP-9、MMP-2在蛋白和mRNA表達(dá)水平均呈顯著負(fù)相關(guān)，這與以往研究的相關(guān)結(jié)論一致。因此筆者考慮：在結(jié)腸癌發(fā)病過(guò)程中，Kiss-1促使MMP-9和MMP-2基因發(fā)生紊亂、酶原產(chǎn)生增加、降解腫瘤細(xì)胞基膜的IV型膠原、層黏連蛋白等成分和破壞基底膜的完整性，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。由此推測(cè)Kiss-1抑制MMP-9和MMP-2的表達(dá)，其調(diào)控機(jī)制可能與抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。

圖4 Western-blot檢測(cè)Kiss-1、 MMP-9和MMP-2在3組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞蛋白的表達(dá) 1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：實(shí)驗(yàn)組 與空白對(duì)照組比較,a：P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，c：P<0.05

綜上所述,Kiss-1 基因的高表達(dá)與抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的形成密切相關(guān)，可能通過(guò)抑制MMP-9和MMP-2的表達(dá)而抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的形成。因此，深入研究 Kiss-1 基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制將為結(jié)腸癌患者的治療開(kāi)辟一條新的途徑。

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TheEffectofKiss-1HighExpressionOnInhibitingInvasionandMetastasisofColonCancer

LIU Diqun，WEN Cailing，ZHONG Hua，et al

(DepartmentofGastroenterology，theFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveTo explore the effect of Kiss-1 high expression on invasion and metastasis of the colon cancer SW480 cells.To preliminarily define the influence of kiss-1 genes to the expressions of matrix metalloproteinase-9(MMP-9) and MMP-2.MethodsTo guide plasmids pEGFP-N1-Kiss-1 and pEGFP-N1 into the colon cancer SW480 sells instantly with the method of lipofectin transfection.Divide cells into three groups:the blank control group with no transfection cell,the negative group with transfection of the empty pEGFP-N1 cell,the experimental group with transfection of plasmid pEGFP-N1-Kiss-1 cell and up-regulation Kiss-1 expression level in colon cancer cells.Applicate Transwell experiment to detect the invasion ability of the colon cancer cells.Western blot and Real-time PCR,respectively from protein and the level of mRNA,were used to detect the influence of Kiss-1 expression to the expressions of MMP-9 and MMP-2.ResultsSuccessfully guided pEGFP-N1-Kiss-1 recombinant plasmid into the colon cancer SW480 sells.Transwell experiments detected that the experimental group,compared with the negative control group and the blank control group,can obviously reduce SW480 cells invasion ability (P<0.05).Western blot and Real-time PCR detected that the experimental group Kiss-1 protein and mRNA expression level increased significantly,while MMP-9,MMP-2 protein and mRNA expression level decreased significantly,compared with negative control group or blank control group,the differences were statistically significant (P<0.05).ConclusionKiss-1 can inhibit the expressions of MMP-9 and MMP-2.Its regulatory mechanism may be related to its inhibition to the invasion and metastasis ability of colon cancer.

SW480 colon cancer cells; Kiss-1; MMP-9; MMP-2; invasion; metastasis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.007

2015-05-11；

2015-07-29

湖南省教育廳一般項(xiàng)目(11C1107).

*通訊作者，E-mail：lixiaoyush@163.com.

R735.35

A

(此文編輯：蔣湘蓮)