陳君灝， 章曉鷹

(上海市中醫(yī)藥大學 附屬曙光醫(yī)院檢驗科，上海 201203)

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617株耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥性及其產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型研究

陳君灝， 章曉鷹*

(上海市中醫(yī)藥大學 附屬曙光醫(yī)院檢驗科，上海 201203)

探討耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥性及其產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型。收集2011年7月至2013年12月上海市中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院臨床分離的銅綠假單胞菌共1 125株，篩選亞胺培南耐藥株，常規(guī)紙片法檢測其耐藥性，并用E-test檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)，采用PCR法檢測耐藥基因型。結(jié)果顯示，1 125株銅綠假單胞菌中耐亞胺培南銅綠假單胞菌共計617株，占54.8%；亞胺培南敏感銅綠假單胞菌共計508株，占45.2%。617株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌100%為多重耐藥，而亞胺培南敏感銅綠假單胞菌的多重耐藥率僅為13.78%，明顯較前者低(χ2=871.15，P<0.05)；亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌中MBL表型陽性共126株，陽性率為15.4%，94株(74.60%)表現(xiàn)為VIM-2陽性，10株(7.94%)表現(xiàn)為IMP-1陽性，1株檢出OXA-10，且該例菌株同時表達VIM-2。臨床分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌多為多重耐藥，其產(chǎn)MBL的主要基因型是VIM-2。

亞胺培南；銅綠假單胞菌；耐藥性；分子機制

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, Pa)是引起院內(nèi)獲得性感染常見的條件致病菌，且其在醫(yī)院的分離率列居第2位，僅次于大腸埃希菌[1]，亞胺培南(imipenem, IPM)是目前臨床上治療銅綠假單胞菌感染常用的碳青霉烯類抗生素，但近年耐亞胺培南的銅綠假單胞菌株逐漸上升，不僅如此，耐碳青霉烯的銅綠假單胞菌大多為多重耐藥株[2]，給臨床治療帶來很大的困擾。而且，銅綠假單胞菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)引起的耐藥已經(jīng)成為當前全球非常重要的院內(nèi)感染問題。IPM-1與VIM-2基因編碼產(chǎn)生的金屬β-內(nèi)酰胺酶是產(chǎn)生耐亞胺培南銅綠假單胞菌的主要原因[3]，掌握并分析Pa通過產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶介導的耐藥率及其耐藥機制對防控耐藥的Pa至關(guān)重要。本研究通過對臨床標本中分離到的耐亞胺培南銅綠假單胞菌(imipenem resistant Pa, IPMRPa)的耐藥性進行分析，檢測其相關(guān)攜帶的耐藥基因，初步探討其耐藥的分子機制，以期為臨床用藥提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2011年7月至2013年12月上海市中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院臨床分離的Pa共1 125株，去除同一病例相同部位分離的菌株。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)購自衛(wèi)生與計劃生育委員會臨床檢驗中心。

1.1.2 試劑與儀器 E-test 試紙條：用于檢測MBL，分成亞胺培南/亞胺培南+EDTA (IP/IPI)，其抗菌濃度范圍為4～256 mg/ (IP)和1～64 mg/L (IPI)，購自法國生物梅里埃公司。儀器：生物安全柜(江蘇安泰)，超凈工作臺(蘇州凈化)，WBS-100 比濁儀(北京六一)，ESCO二氧化碳培養(yǎng)箱(新加波)，PCR儀(nexus gradient eppendorf公司)，M-H瓊脂商品培養(yǎng)基(法國生物梅里埃公司)，全自動細菌鑒定儀VITEK2-compact(法國生物梅里埃公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)，引物均由上海英駿生物公司合成(高效液相色譜法純化)，高速離心機(Thermo 公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感試驗方法 藥敏紙片：亞胺培南(IMP, 10 μg)、阿米卡星(AMK, 30 μg)、環(huán)丙沙星(CIP, 30 μg)、左氧氟沙星(LVX,5 μg)、氨曲南(ATM, 30 μg)、美羅培南(MEM，10 μg)、慶大霉素(GEN,10 μg)、頭孢他啶(CAZ, 30 μg)、頭孢吡肟(FEP, 30 μg)、哌拉西林(PIP, 100 μg)，哌拉西林/他唑巴坦(TZP, 100/10 μg)，均為OXID公司產(chǎn)品，在保質(zhì)期內(nèi)使用。所有菌株按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行樣本留取接種，采用VITEK細菌鑒定儀進行菌種鑒定，以銅綠假單胞菌(ATCC27853)為質(zhì)控菌株,根據(jù)美國CLSI 2008年版要求采用K-B法測定以上11種抗菌藥物的敏感性。

1.2.2 E-test法檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL) 取0.5麥氏單位細菌懸液均勻涂布于M-H平板后，將試紙條貼在平板上，35 ℃培養(yǎng)18 h，讀取試紙條兩端的最小抑菌圈濃度，以IP/PIP≥3，或試紙條中間空白區(qū)出現(xiàn)協(xié)同抑菌圈，或無抑制劑的一端抑菌圈尾部變形判斷為MBL陽性[4]。

1.2.3 MBL基因型分析 ①模板制備：從分離純化的樣本菌株瓊脂平板上挑取單個克隆菌落，接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃，置于水平搖床上160 r/min 搖震培養(yǎng)16 h，運用煮沸法提取細菌DNA，吸取1 mL 菌液于EP管，12 000 r/min離心1 min，棄上清后加入500 μL無菌蒸餾水，吹勻菌液，95 ℃水浴10 min，12 000 r/min離心 10 min，吸取上清；酚：氯仿/異戊醇抽提1次，無水乙醇沉淀1 h后，各管產(chǎn)物溶于200 μL水，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。②引物設(shè)計：參考文獻[5]設(shè)計引物，并將引物序列導入Primer 5引物設(shè)計軟件進行驗證。PCR體系設(shè)置為20 μL，如下：2×PCR mix 10 μL, sense/antisense: 1 μL/1 μL (6 μmol/L)，DNA樣品 3 μL，H2O 5 μL?；靹蚝笾糜赑CR管離心機上，12 500 r/min 離心10 s，將液體全部甩至管底后置于PCR儀上。引物序列：VIM-2: Sense: 5′-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3′, Antisense: 5′-AGGTGGGCCATrCAGCCAGA-3′ Product: 523 bp;IMP-1: sense: 5′-ATGAGCAAGTTATCTGTATTC-3′, Antisense: 5′-TTAGTTGCTTGGTTTTGATG-3′ Product: 741 bp;OXA-10: Sense: 5′-TCAACAAATCGCCAGAGAAG-3′, Antisense：5′-TCACAACAACTAAAAGCACTG-3′, Product：276 bp。③PCR擴增條件：S1: 95 ℃，10 min；S2: 95 ℃，50 s；S3: 55 ℃(OXA), 56 ℃(VIM、IMP), 50 s; S4: 72 ℃，50 s; S2～S4循環(huán)30次，陰性對照為以H2O代替模板加入PCR體系。產(chǎn)物點樣于1% 瓊脂糖，電泳條件為5 V/cm，30 min，與DL3000 marker同時電泳。

1.2.4 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計分析采用SPSS17.0軟件。所觀測資料主要為細菌耐藥性(以耐藥率表示)等，均為一般計數(shù)資料。兩菌株樣本組間比較采用χ2檢驗。顯著性水準α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 IPMRPa與非IPMRPa的耐藥性比較

1 125株P(guān)a中，IPMRPa共計617例，占54.8%；非IPMRPa共計508例，占45.2%。IPMRPa與非IPMRPa的耐藥性比較見表1。

表1 IPMRPa與非IPMRPa的藥敏試驗結(jié)果

注：IPMRPa：耐亞胺培南銅綠假單胸菌

2.2 多重耐藥比較

目前把對亞胺培南、頭孢他啶、哌拉西林、環(huán)丙沙星4種藥物均耐藥的Pa定義為多藥耐藥(MDRPa)[6]。本文比較了IPMRPa/非IPMRPa對其他抗生素的耐藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，617株IPMRPa 100%為多重耐藥(對3類或3類以上藥物同時耐藥)，而非IPMRPa的多重耐藥率僅為13.78%，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=871.15，P<0.05)。見表2。

表2 IPMRPa/非IPMRPa多重耐藥性比較

Table 2 Comparison of multi-drug resistance of IPMRPa and non-IPMRPa

菌株數(shù)量/n多重耐藥數(shù)/%非多重耐藥數(shù)/%IPMRPa617617(100.0)0(0.0)非IPMRP50870(13.8)438(86.2)

2.3 產(chǎn)MBL菌株檢測及其基因型分析

E-test結(jié)果顯示：617株亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌，MBL表型陽性共126株，陽性率為15.4%。

對126株產(chǎn)MBL菌株檢測其產(chǎn)MBL基因型的結(jié)果顯示，共有94株(74.60%)表現(xiàn)為VIM-2陽性(擴增產(chǎn)物大小523 bp)；10株(7.94%)表現(xiàn)為IMP-1陽性(擴增產(chǎn)物大小為741 bp)，1株為OXA-10(擴增產(chǎn)物大小為276 bp)，且該例菌株同時表達VIM-2,見圖1。其余菌株檢測結(jié)果均為陰性。

圖1 VIM-2、IMP-1、OXA-10基因擴增圖Fig.1 Gene amplification of VIM-2, IMP-1 and OXA-10梯度條帶表示DL3 000 marker;1：VIM-2; 2：IMP-1; 3：OXA-10; 4：陰性對照 Gradient bands represent DL3 000 marker; 1：VIM-2; 2：IMP-1; 3：OXA-10; 4：Negative control

3 討 論

銅綠假單胞菌是臨床常見的條件致病菌，其臨床分離率已經(jīng)占到革蘭陰性細菌總數(shù)的20%～23%[7]。其本身可選的抗生素范圍比較窄，臨床用于Pa感染的抗生素主要是β-內(nèi)酰胺類，氨基糖苷類與喹諾酮類。Pa對氨基糖苷類抗生素的耐藥性最低，為15%左右[8-9]；而其對喹諾酮類的耐藥性在20%左右；在β-內(nèi)酰胺類抗生素中，碳青霉烯類的亞胺培南是目前臨床對Pa效果比較好的抗生素，而目前其耐藥性也在以較快的速度上升，這可能和近年來臨床上亞胺培南頻繁使用導致耐藥菌株被選擇出來并廣泛傳播有關(guān)。研究表明，目前喹諾酮類與氨基糖苷類抗生素仍然是治療Pa感染有效的抗生素。

IPMRPa分離率逐年上升已經(jīng)引起臨床的足夠重視，而產(chǎn)金屬酶是Pa對亞胺培南耐藥的主要機制，介導Pa耐藥的MBL可由質(zhì)粒與染色體雙重介導[10]。其發(fā)揮活性依賴于Zn2+，其作用主要是通過水解包括碳青霉烯類在內(nèi)的絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素，此外，OXA-10屬于D類β-內(nèi)酰胺酶,也可以水解碳青霉烯類抗生素，進而介導Pa對亞胺培南的耐藥。了解臨床分離的亞胺培南耐藥Pa的耐藥機制，對指導臨床治療Pa所致的感染及控制耐藥性的播散具有重要意義。

本研究檢測了臨床分離的Pa菌株對亞胺培南的敏感性，結(jié)果顯示，超過一半的Pa表現(xiàn)出對亞胺培南的耐藥，與杜艷等[11]報道的數(shù)據(jù)接近。研究還發(fā)現(xiàn)，對亞胺培南耐藥的Pa均表現(xiàn)出多重耐藥性，而非亞胺培南耐藥的Pa的多重耐藥性則明顯要低，這可能提示介導耐亞胺培南的機制本身就是多樣的，其除了可以導致該菌株對亞胺培南耐藥外，還可以導致對其他抗生素耐藥，并不能排除多重耐藥性是由各自相互獨立的原因所導致。

本研究在20.4%的耐亞胺培南菌株中檢出MBL，這一比例較國內(nèi)其他報道稍高[12-13]，在所分離的MBL陽性菌株中檢測了VIM-2、IMP-1、OXA-10基因型的存在，結(jié)果表明絕大多數(shù)(74.60%)的細菌是VIM-2陽性，只有7.94%的表現(xiàn)為IMP-1陽性，且同時還有1例是OXA-10陽性。這表明目前上海市中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院Pa產(chǎn)MBL主要是由VIM-2基因介導，沒有分離出VIM-2與IMP-1同時雙陽性的菌株，但發(fā)現(xiàn)了1例VIM-2與OXA-10雙陽性的菌株，盡管VIM-2與OXA-10所引起的耐藥機制不盡相同，但其表達產(chǎn)物均可導致對亞胺培南的耐藥，表明同一菌株可能會同時出現(xiàn)抵抗同一類抗生素的多個耐藥基因。

綜上所述，IPMRPa在臨床具有較高的分離率，其耐藥譜廣且有向單一菌株多重耐藥發(fā)展的表現(xiàn)，提示臨床上應加強病原學檢查，根據(jù)藥物敏感性結(jié)果選擇藥物，以達到最佳的治療效果。

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Drug Resistance & Genotype of Extended Spectrum β-Lactamases among 617 Cases of Imipenem-ResistantPseudomonasaeruginosa

CHEN Jun-hao, ZHANG Xiao-ying

(Dept.ofLab.,Affil.ShuguangHosp.ofShanghaiUni.ofTCM,Shanghai201203)

The drug resistance and genetype genotype of super-broad spectrum β-lactamase of imipenem-resistantPseudomonasaeruginosawere investigated. 1 125 strains ofP.aeruginosaisolated from Shanghai TCM University affiliated Shuguang Hospital collected from July 2011 to December 2013 were screened for imipenem-resistant strains, and detected their drug resistance with routine paper sheet, and adopted E-test to detect metal β-lactamase (MBL) PCR to detect their drug resistance genotype. The results showed that of all 1 125P.aeruginosastrains 617 strains (54.8%) was imipenem-resistant, while 508 (45.2%) were imipenem-sensitive. 617 strains of imipenem-resistantP.aeruginosawere all multi-drug resistant (100%), while the rate imipenem sensitive strains was only 13.78%, obviously lower than the former (χ2=871.15,P<0.05). 126 strains of imipenem-resistantP.aeruginosawere MBL phenotypic, with positive rate of 15.4%, of them 94 strains (74.60%) wereVIM-2 positive, 10 strains wereIMP-1 positive; one strain was detected asOXA-10 and simultaneously expressedVIM-2. Therefore, clinically isolated imipenem-resistantP.aeruginosawere mostly multi-drug resistant, the MBL-producing genotype manly wasVIM-2.

imipenem;Pseudomonasaeruginosa; drug resistance; molecular mechanisms

陳君灝 男，主管檢驗師。主要從事微生物臨床檢驗相關(guān)工作。E-mail：chenjunhao897@163.com

2015-08-07；

2015-08-25

Q939.11+2

A

1005-7021(2015)06-0078-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.015

* 通訊作者。女，碩士，主任檢驗師。主要從事PCR室相關(guān)研究與檢驗工作。