涼茶中DNA提取方法的建立

王立平，蔡雪鳳，劉曉莉，曹悅，李樹(shù)垚

（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

涼茶中DNA提取方法的建立

王立平，蔡雪鳳，劉曉莉，曹悅，李樹(shù)垚

（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

以涼茶植物源性飲品為研究對(duì)象，比較了1種硅膠柱法商品試劑盒和傳統(tǒng)CTAB法提取涼茶食品基因組DNA的效果；通過(guò)紫外分析法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)所提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，比較所得DNA的濃度和純度，以及對(duì)下游檢測(cè)的適用性。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)CTAB法相比，研究所建立的方法提取到的DNA無(wú)PCR抑制劑，濃度和純度能滿足后續(xù)PCR檢測(cè)要求。

涼茶；核酸提取；方法比較

涼茶是我國(guó)南方沿海地區(qū)居民根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂颉⑺撂匦?，在長(zhǎng)期預(yù)防疾病與保健的過(guò)程中以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導(dǎo)，以天然中草藥，如金錢(qián)草、布渣葉、崗梅根、木蝴蝶、火炭毋、淡竹葉、金沙藤、五指柑等為原料，用獨(dú)特的煲制方法煎熬而成的一種湯劑，具有清熱解毒、生津止渴、防治疾病等功效，也是民間世代流傳的被廣泛飲用的傳統(tǒng)保健飲品。但目前在涼茶原材料來(lái)源上存在一些問(wèn)題，如藥材種類(lèi)摻假。炒的沸沸揚(yáng)揚(yáng)的金銀花門(mén)事件，就是用價(jià)格低廉的山銀花冒充金銀花。要實(shí)現(xiàn)對(duì)涼茶中中草藥成分真實(shí)性鑒定可借助于PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)手段。通過(guò)提取殘留于涼茶中的特定藥材的DNA（脫氧核糖核酸）片段，設(shè)計(jì)適宜引物，擴(kuò)增目標(biāo)片段，借助瓊脂糖電泳技術(shù)或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)中藥材真實(shí)性鑒定。

但PCR方法鑒定準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性的重要前提條件是所提取DNA的濃度和質(zhì)量，而這取決于DNA提取方法，特別是對(duì)PCR抑制劑的有效去除。已報(bào)道的PCR抑制劑有：NaCl、二價(jià)鹽、SDS（十二烷基磺酸鈉）、糞便中的多糖、尿中的尿素、血液中的血紅素、牛奶中的蛋白酶、土壤中的腐殖質(zhì)等等[1-2]。這些抑制劑一般是通過(guò)以下幾種方式單一或混合進(jìn)行抑制：（1）干擾細(xì)胞裂解；（2）解或捕獲核酸；（3）使DNA聚合酶失活或活性降低[1，3]。

涼茶中成分復(fù)雜，工藝過(guò)程需經(jīng)過(guò)加熱熬制，導(dǎo)致植物DNA片段斷裂和破碎；涼茶中所生成的色素成分對(duì)后續(xù)PCR反應(yīng)過(guò)程所產(chǎn)生的抑制作用，導(dǎo)致PCR檢測(cè)的失敗。因此，所采用DNA提取方法，獲取高純度的目標(biāo)DNA片段至關(guān)重要。

目前在植物源食品中提取DNA的方法主要有傳統(tǒng)CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法，SDS法，硅膠柱試劑盒法，磁珠試劑盒法[4-5]。但如何獲取涼茶中高質(zhì)量的DNA的提取方法至今尚無(wú)研究報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中考慮到PCR抑制劑的影響，采用了硅膠柱提取DNA的方法，并與傳統(tǒng)CTAB法加以比較，確定最適宜的涼茶中DNA的提取方法。

1 材料與方法

1.1 試劑材料及儀器設(shè)備

1.1.1 試劑材料

市售不同品牌的涼茶；FeCl3·6H2O；乙二醇、三乙二醇、醋酸鈉；十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇8000、四乙氧基硅烷（TEOS）；CTAB；NaCl；蛋白酶K；鹽酸胍；瓊脂糖；PCR試劑（天根生物技術(shù)公司）；D Neasy mericon Food Kit（QIAGEN）；DNA marker（50 bp～450 bp）。

1.1.2 引物和探針

PCR采用植物18SrDNA基因?yàn)榘行蛄械囊颷6]。上游引物：5’-CCTGAG AAA CGGCTA CCA T-3’下游引物：5’-CGT GTC AGG ATT GGG TAA T-3’探針：5’FAM-TGC GCG CCT GCT GCC TTC CT-3'TAMRA。

1.1.3 儀器設(shè)備

凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國(guó)）；核酸蛋白微量定量?jī)x（Nano Drop，美國(guó)）；高速離心機(jī)（SIGMA，德國(guó)）；實(shí)時(shí)熒光PCR儀（ABI7300，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 兩種涼茶中DNA提取方法

CTAB法：見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]；Qiagen硅膠柱法：實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 提取基因組DNA的紫外分光光度檢測(cè)

用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA在260 nm處的吸光值（A260），計(jì)算所提DNA的濃度，DNA的質(zhì)量濃度（μg/mL）=A260×50。檢測(cè)基因組DNA在260、280 nm處的吸光值，根據(jù)A260/A280值判斷DNA純度。

1.2.3 Rea1-Time PCR初步擴(kuò)增體系

反應(yīng)體系為25.0μL。Master Mix：10μL；上、下游引物（10μmol/L）：各1.0μL；分子信標(biāo)探針（5.0μmol/L）：1μL；probe Enhancer solution：1.25μL；DNA模板：10.75μL。實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)條件：50℃2min；95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)模板DNA均做2個(gè)平行。

1.2.4 檢測(cè)抑制劑

以提取的樣品DNA液8.75μL為抑制劑，以大豆提取的DNA為陽(yáng)性模板，按1.2.3Rea1-Time PCR進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，確定所提取的樣品DNA中是否有PCR抑制劑的存在和干擾。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種DNA方法提取結(jié)果的比較

涼茶是中草藥深加工制品，DNA在加工過(guò)程中不可避免受到損傷、斷裂和降解。且所含的植物多糖和色素，對(duì)提取樣品總DNA效率及純度產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而影響下一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定。因此，采用兩種方法提取涼茶中的DNA，比較結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 涼茶中總DNA提取方法比較（DNA濃度為（ng/μL））Table 1 Comparison of QIAquickRSpin Columns DNA extraction kit and CTAB method

從表1中可看出，不同的DNA提取方法所獲取DNA提取液的濃度和純度存在一定差異。在DNA提取液顏色上，傳統(tǒng)CTAB法DNA提取液呈淡黃色，而采用Qiagen硅膠柱法提取的DNA為正常的無(wú)色透明液體。在260/280的比值方面，兩種DNA提取液的260/280的比值范圍波動(dòng)較大，傳統(tǒng)CTAB法提取液260/280的比值在0.98～1.15之間?？赡苁窃谔崛∵^(guò)程中植物多糖去除效果不好，導(dǎo)致DNA提取液中植物多糖含量高。提取液中DNA濃度差別較大，從幾ng/μL～幾十ng/μL不等。從以上結(jié)果看到，不同的DNA提取方法，由于所采用的機(jī)理不同，提取的效果確實(shí)存在一定差異?？紤]到?jīng)霾铻樯罴庸ぶ破?，植物中DNA在產(chǎn)品加工生產(chǎn)過(guò)程中的加熱熬制導(dǎo)致DNA降解，斷裂為小片段。因此，DNA提取液的260/280的比值、顏色及濃度可為下一步實(shí)驗(yàn)提供參考。

2.2 兩種方法提取DNARea1-Time PCR結(jié)果

以兩種方法提取的涼茶的基因組DNA為模板，采用植物18SrDNA序列設(shè)計(jì)的引物和探針?lè)謩e對(duì)市售的三種涼茶提取的DNA進(jìn)行Rea1-Time PCR擴(kuò)增測(cè)定，確定兩種提取方法的可行性，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 CTAB法Real-Time PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 The curve of Real-Tim e PCR by CTAB method

圖2 Qiagen硅膠柱法Real-Time PCR擴(kuò)增曲線Fig.2 The curve of Real-Time PCR by Qiagen spin columns DNA extraction method

從Rea1-Time PCR擴(kuò)增曲線可知，除陽(yáng)性對(duì)照有明顯擴(kuò)增曲線外，采用Qiagen硅膠柱提取試劑盒提取的三種涼茶DNA有擴(kuò)增曲線；而傳統(tǒng)CTAB法獲取的三種涼茶DNA均無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線；從2.1中測(cè)定結(jié)果可知，采用Qiagen硅膠柱提取試劑盒提取的三種涼茶DNA含量低于傳統(tǒng)CTAB法。因此推測(cè)傳統(tǒng)CTAB法獲得的DNA液中可能存在PCR抑制物質(zhì)。所做的推測(cè)有待下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 抑制劑檢測(cè)結(jié)果

以大豆提取的DNA為陽(yáng)性模板，在Real-Time PCR反應(yīng)體系（25.0μL）中添加體積為2.0μL（100.0 ng/μL），同時(shí)在每個(gè)反應(yīng)體系中添加8.75μL的傳統(tǒng)CTAB法獲取的三種涼茶DNA液，添加引物、探針及Master mix后進(jìn)行Real-Time PCR，檢測(cè)DNA提取液中是否存在PCR抑制劑。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 CTAB法抑制劑Real-Time PCR擴(kuò)增曲線Fig.3 The curve of Real-Time PCR by CTAB method containing PCR inhibitors

從圖3的Rea1-Time PCR擴(kuò)增曲線圖可知，除陽(yáng)性對(duì)照有明顯擴(kuò)增曲線外，傳統(tǒng)CTAB法提取的三種涼茶DNA均含有PCR抑制劑，導(dǎo)致添加該三種方法提取的DNA液的陽(yáng)性樣品無(wú)擴(kuò)增曲線。該結(jié)果表明，傳統(tǒng)CTAB法不能有效去除樣品中PCR抑制劑，特別是色素類(lèi)的PCR抑制劑。目前，對(duì)于如何去除DNA提取液中PCR抑制劑有相關(guān)的研究報(bào)道[8]。利用去除PCR抑制劑物質(zhì)能否有效去除DNA提取液中PCR抑制劑有待下一步研究。

3 結(jié)論

涼茶含有糖類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)、及色素類(lèi)物質(zhì)等，這些物質(zhì)直接影響著PCR以及熒光PCR反應(yīng)中Taq酶的活性，并且對(duì)熒光PCR的定量結(jié)果有著更大的影響。因此建立提取該類(lèi)產(chǎn)品基因的方法得到質(zhì)量較好的基因組DNA至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)中，與傳統(tǒng)CTAB法相比較，Qiagen硅膠柱提取法在獲取目標(biāo)DNA片段更具優(yōu)勢(shì)，能獲得較好質(zhì)量的涼茶產(chǎn)品中的DNA片段，能滿足下一步實(shí)驗(yàn)的要求。

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DNA Extraction Methods of Herbal Tea

WANG Li-ping，CAI Xue-feng，LIU Xiao-li，CAO Yue，LI Shu-yao
（China National Food Quality＆Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

Two current DNA extraction methods for processed foods of herbal tea were compared in the study. These methods included one kind of QI AquickRSpin Columns DNA extraction kits and CTAB method.The extracted DNA were detected to compare concentration，purity and suitability to posterior detection by UV analysis，fluorescence quantification PCR.The results showed that the purity of and concentration extracted DNA from herbal tea was without PCR inhibitor by our established method and could meet the requirement of posterior PCR detection.

herbal tea；DNA extraction；methods comparison

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.022

2013-12-11

王立平（1968—），女（蒙古），高級(jí)工程師，博士，主要研究方向：食品微生物。