銅色牛肝菌活性胞外多糖的發(fā)酵優(yōu)化研究

許春平，劉遠上，李萌姍，趙姍姍，史超文

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002，2.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州450002）

銅色牛肝菌活性胞外多糖的發(fā)酵優(yōu)化研究

許春平1，劉遠上1，李萌姍1，趙姍姍1，史超文2

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002，2.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州450002）

選擇發(fā)酵液中的胞外多糖含量為生物指標，對其進行培養(yǎng)基（碳源、氮源、無機鹽）和環(huán)境條件（pH、溫度）的優(yōu)化，最后確定了蔗糖50 g/L，酵母粉5 g/L的最優(yōu)培養(yǎng)基和溫度=25℃，pH=6的最優(yōu)培養(yǎng)條件；用優(yōu)化后的條件通過5 L式發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)銅色牛肝菌，5天后胞外多糖產(chǎn)量達1.84 g/L。胞外多糖經(jīng)除蛋白后，通過ABTS、DPPH、臨二氮菲法測其抗氧化性，結(jié)果表明其胞外多糖具有很好的抗氧化能力。

銅色牛肝菌；胞外多糖；液體發(fā)酵；優(yōu)化；抗氧化

銅色牛肝菌（Boletusaereus Fr.ex Bull）傘菌目、牛肝菌科、牛肝菌屬，夏秋季生于櫟等林中地上，可以食用，味道好，是一種食藥用真菌，屬于外生菌根菌。但是不能人工栽培，可用菌絲體進行深層發(fā)酵培養(yǎng)[1]。

食藥用真菌具有有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血糖、抗病毒等功效，而這些功效的發(fā)揮與真菌多糖有著密切的關(guān)系[2]。真菌多糖是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，具有復雜的生物活性和功能[3]，可提高免疫力調(diào)節(jié)身體的各項機能[4]。真菌多糖分為胞內(nèi)多糖和胞外多糖，胞外多糖主要從發(fā)酵液中提取，因為液體發(fā)酵可以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)多糖，生產(chǎn)周期短，操作簡單等優(yōu)點，現(xiàn)在工業(yè)化生產(chǎn)多糖大多采用液體發(fā)酵法[5-7]，尤其是銅色牛肝菌，只能通過液體深層發(fā)酵獲得大量多糖。

本文主要是對銅色牛肝菌深層發(fā)酵培養(yǎng)基和環(huán)境條件進行優(yōu)化，為工業(yè)化生產(chǎn)銅色牛肝菌多糖提供理論依據(jù)，并且通過臨二氮菲法、DPPH法、ABTS法測定銅色牛肝菌胞外多糖的抗氧化性，探索其對各種自由基的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

銅色牛肝菌菌種來自于河南省生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯25%，葡萄糖1%，瓊脂1.5%～2.0%），液體種子培養(yǎng)基（葡萄糖3%，蛋白胨0.3%）。

1.1.3 試劑

乙醇、濃硫酸、DPPH、鄰二氮菲、1.5%過氧化氫、FeSO4均為分析純；ABTS試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.4 儀器

JYT-5QYC200恒溫振蕩搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；5L攪拌式真菌發(fā)酵罐：上海百倫科技有限公司；METTLER 4E200電子分析天平：上海沛歐分析儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；CF16RXⅡ日立離心機：日本HITACHI；UV-17001C紫外分光光度計：上海鳳凰光學科儀有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

將保存于試管斜面培養(yǎng)基中的銅色牛肝菌菌絲塊接種于PDA平板培養(yǎng)基上，26℃下培養(yǎng)7 d[8]。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)

用打孔器打取活化好的PDA銅色牛肝菌絲塊（約1 cm2）兩塊接入含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于于26℃160 r/min恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)4d。然后加入滅過菌的玻璃珠置于磁力攪拌器上將菌絲塊打碎后備用。

1.2.3 葡萄糖標準曲線的測定

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品1 g，溶解稀釋后定容到100mL容量瓶中，配成10mg/mL的葡萄糖貯備液，精密吸取貯備液1mL定容至100mL，配成0.1mg/m L的葡萄糖標準液。精密移取葡萄糖標準液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μL，于25mL具塞刻度試管中，加蒸餾水至1.0mL，再各加5%苯酚溶液1mL搖勻，迅速加入濃硫酸溶液5m L，放在振蕩器上震蕩均勻，置沸水浴中加熱15 min，取出再置于冰水中15 min，用紫外分光光度計于490 nm，以蒸餾水代替葡萄糖溶液作為對照測定吸光值。

1.2.4 單因素實驗

探究不同碳源、氮源、無機鹽、pH、溫度對銅色牛肝菌胞外多糖含量的影響，基礎培養(yǎng)基為3%葡萄糖，0.3%蛋白胨，每組實驗設3個平行試驗，培養(yǎng)時間為8 d，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為4%，pH=5。碳源選用的是3%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、木糖、乳糖；氮源選用的是0.3%的牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、大豆粉、磷酸銨、硝酸鉀；無機鹽選用的是FeSO4、MnCl2、MgSO4、CaCl2、K2HPO4和空白對照（3%葡萄糖，0.3%蛋白胨）；pH=3、4、5、6、7、8、9；溫度=20、25、28、30℃。

1.2.5 碳源濃度和C/N比實驗

在單因素實驗基礎上，探究碳源濃度和碳氮比對銅色牛肝菌胞外多糖含量的影響。碳源濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%；碳氮比分別為1∶1、10∶1、20∶1、30∶1。每組實驗設3個平行試驗，培養(yǎng)時間為8 d，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

1.2.6 菌絲干重的稱量和胞外多糖含量的測定

用抽濾法[9]將菌絲和發(fā)酵液分離，將濾紙和菌絲置于70℃的烘箱至干燥后稱量，再除去濾紙干重即為菌絲干重。

菌體含量（g/L）=菌絲干重（g）/發(fā)酵液體積（m L）× 1 000

把發(fā)酵液濃縮后加入4倍乙醇，置于4℃冰箱過夜處理，第2天把處理液放在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min離心機中離心10min后棄去上清，用蒸餾水溶解沉淀定容至250mL，然后用苯酚硫酸法[10]測發(fā)酵液中的多糖含量。

1.2.7 銅色牛肝菌在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)

根據(jù)單因素優(yōu)化和交互作用實驗確定的培養(yǎng)基配方配制3 L于5 L發(fā)酵罐中，接種量4%，通氣量2 vvm，攪拌速度160 r/min，培養(yǎng)8 d，然后將發(fā)酵液濃縮后醇沉[11]出胞外多糖冷凍干燥以備后用。

1.2.8 胞外多糖的抗氧化作用

ABTS法測定銅色牛肝菌胞外多糖的總抗氧化力。ABTS在一定的氧化劑作用下可以氧化成綠色的ABTS，當有抗氧化物存在時ABTS的氧化就會被抑制，在734 nm或405 nm測定ABTS的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力[12]。Trolox是一種維生素E的類似物，具有和維生素E相近的抗氧化能力，可以作為其它抗氧化物總抗氧化能力的參照物。

DPPH法測定胞外多糖對DPPH的清除率。DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，有自由基清除劑存在時，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長處的吸光值下降，且下降程度呈線性關(guān)系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，從而可以計算出樣品的抗氧化能力[13]。

臨二氮菲法測定胞外多糖對·OH的清除率[14]，以前是利用鄰二氮菲可與Fe2+生成橙紅色有色物用來檢測樣品中Fe2+的方法。由于H2O2在Fe2+的催化作用下生成具有高反應活性的羥基自由基（Fenton反應）能夠氧化反應體系中的Fe2+，因此出現(xiàn)了用來檢測Fenton反應產(chǎn)生羥自由基的鄰二氮菲法。

2 結(jié)果分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線圖Fig.1 Glucose standard curve graph

2.2 碳源、氮源、無機鹽對多糖含量的影響

碳源、氮源、無機鹽對多糖含量的影響見表1。

表1 不同碳源、氮源、無機鹽對銅色牛肝菌菌絲含量和胞外多糖含量的影響*Table1 Effect of carbon，nitrogen and mineral source on mycelial growth and EPS production by B.aereus in shake flask cultures*

由表1分析可知，蔗糖＞麥芽糖＞葡萄糖＞果糖=乳糖＞木糖，麥芽糖和蔗糖作為碳源都能獲得較高的多糖含量，但是在工業(yè)化生產(chǎn)中，蔗糖的成本更低，而且能產(chǎn)得更多的菌絲，所以選擇蔗糖作為最優(yōu)碳源，葡萄糖、果糖、乳糖、木糖作為碳源，胞外多糖含量比較接近。

在氮源的優(yōu)化過程中，可以觀察到，銅色牛肝菌在有機氮源的培養(yǎng)基中生長很好，在無機氮源的培養(yǎng)基中生長很慢并且菌絲很少，說明銅色牛肝菌不能很好的利用無機氮源。而在有機氮源中富含各種氨基酸，這些氨基酸可以直接被菌絲吸收加以利用，因此利用這種氮源時，菌絲生長較快，胞外多糖產(chǎn)量相對較高[15]。無論是選擇發(fā)酵液中的胞外多糖含量還是菌絲含量作為生物指標，都應該選酵母粉作為最適氮源。

無機鹽的加入并沒有提高銅色牛肝菌胞外多糖的產(chǎn)量，所以在實驗中不再添加無機鹽。

2.3 環(huán)境條件對胞外多糖含量的影響

2.3.1 初始pH對胞外多糖含量的影響

以液體種子培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，其他條件保持不變，培養(yǎng)基pH分別為3、4、5、6、7、8、9，確定最適pH。結(jié)果如圖2（A）所示，銅色牛肝菌在pH=3-9都能生長，最適pH為6。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對胞外多糖含量的影響

以液體種子培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，初始pH=5，其它條件不變，溫度分別為20、25、28、30℃，結(jié)果如圖2（B）所示，溫度為25℃時菌絲含量和多糖含量都是最高，而其它3個溫度差異不明顯。

圖2 不同pH和溫度條件對銅色牛肝菌菌絲含量和胞外多糖含量的影響Fig.2 Effect of pH and temperature on mycelial growth and EPS production by B.aereus in shake flask cultures

2.4 不同碳源濃度和碳氮比對胞外多糖含量的影響

改變碳源濃度，其它條件不變，每組實驗設3個平行實驗，結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 不同碳源濃度對銅色牛肝菌菌絲含量和胞外多糖含量的影響Fig.3 Effect of Carbon concentration on the mycelial growth and EPS production by B.aereus

圖4 不同的碳氮比對銅色牛肝菌菌絲含量和胞外多糖的影響Fig.4 Effect of C/N ratio on the mycelial growth and EPS production by B.aereus

由圖3分析可知，質(zhì)量分數(shù)5%的蔗糖試驗組的菌絲含量和胞外多糖含量最高，而質(zhì)量分數(shù)1%、2%、3%、4%的蔗糖試驗組碳源不足，菌絲體干重和胞內(nèi)外多糖含量較低；質(zhì)量分數(shù)6%的碳源存在時，則抑制菌絲的生長和胞外多糖的合成。所以，質(zhì)量分數(shù)5%為最適碳源濃度。

圖4為不同的碳氮比對銅色牛肝菌菌絲含量和胞外多糖的影響，蔗糖與酵母粉比例達到10：1時，菌絲含量和胞外多糖含量都達到最高水平。正如Yuan et al的實驗結(jié)果，赤芝的碳氮比也是10∶1[16]。綜上所述，最適碳源及濃度為蔗糖：50 g/L，最適氮源及濃度為5 g/L。

2.5 銅色牛肝菌發(fā)酵罐實驗

發(fā)酵時間與pH、菌絲干重、殘?zhí)呛虴PS產(chǎn)量等指標的相關(guān)變化情況見圖5。

圖5 利用5L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中菌絲干重、胞外多糖、pH和殘?zhí)请S時間的變化圖Fig.5 Time course of the mycelial growth，EPS production，pHand residual glucose in 5-L stir red-tank bioreactor.

由圖5分析可知，發(fā)酵液EPS含量從接種首日開始就逐漸升高，在第5天達到最大值（1.84 g/L），此后含量趨向平穩(wěn)。而菌絲干重隨時間的增加而快速升高，在第3天達到最大值，隨后降低。殘?zhí)呛吭诎l(fā)酵過程中不斷減少，但pH變化不是很明顯。

2.6 銅色牛肝菌胞外多糖抗氧化性研究

如圖6（A）所示，總抗氧化力隨著多糖濃度的增加而增大，呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，最后當胞外多糖濃度到10 g/L時，其總抗氧化力與0.171mM Trolox相等，同樣，銅色牛肝菌胞外多糖清除DPPH和·OH自由基的能力都隨著多糖濃度的增大而增強，如圖6（B），多糖濃度由6 g/L到8 g/L的斜率明顯大于2 g/L到6 g/L的斜率，當多糖濃度為10 g/L時，，清除DPPH自由基高達62.23%。并且清除·OH自由基能力也隨著多糖濃度的增加而逐漸增強，如圖6（C）所示，最高清除率達到61.37%。結(jié)果表明銅色牛肝菌胞外多糖具有很好的抗氧化能力，這種能力是因為其分子中有大量的羧基（-COOH）、羰基（C=O）、醚基（-O-）以及其它基團。這些基團與自由基發(fā)生反應時可以提供電子使自由基以一種更穩(wěn)定的形式存在，或者使自由基引起的鏈式反應停止[12]。

圖6 銅色牛肝菌胞外多糖抗氧化效果圖Fig.6 Antioxidant activity of B.aereus polysaccharides.

3 結(jié)語

本實驗以胞外多糖含量為指標，對銅色牛肝菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，最適培養(yǎng)基為：蔗糖50 g/L，酵母粉5 g/L，pH=6，溫度25℃。將優(yōu)化結(jié)果應用于5 L式發(fā)酵罐，培養(yǎng)8 d后處理發(fā)酵液得到胞外多糖，然后通過ABTS、DPPH、臨二氮菲法測其抗氧化性，結(jié)果表明銅色牛肝菌胞外多糖具有很好的抗氧化能力。

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Optimization of Active Exopolysaccharides Production by Submerged Culture of Boletus Aereus

XU Chun-ping1，LIU Yuan-shang1，LI Meng-shan1，ZHAO Shan-shan1，SHI Chao-wen2
（1.College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，Henan，China；2.College of Life Science，Henan Agricultural University Zhengzhou 450002，Henan，China）

In this paper，optimization of liquid culture medium components （carbon and nitrogen sources，mineral salt）and fermentation condition （pH and temperature）to produce exopolysaccharides （EPS）was carried out.The optimum medium was sucrose 50 g/L，yeast extract5 g/L，temperature 25℃，with initial pH at 6.Under the optimized culture conditions in a 5-Lstirred-tank reactor，the EPS was obtained upto 1.84 g/Lat5 d. After after removing protein，the antioxidant activity of EPS was measured by ABTS，DPPH，phenanthroline method.The results showed that the EPS has good antioxidant capacity.

Boletus aereus；exopolysaccharides；liquid fermentation；optimization；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.033

2013-07-15

國家教育部國際合作與交流司“留學人員回國科研啟動基金”教外司留[2012]940

許春平（1977—），男（漢），教授，博士，研究方向：生物化工和煙草工程。