基于分散液-液微萃取技術(shù)的石斛酚含量測定與分析

史 琤，蔣 蕾，馬銀海，涂渝嬌

（昆明學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)系，云南 昆明 650214）

基于分散液-液微萃取技術(shù)的石斛酚含量測定與分析

史 琤，蔣 蕾，馬銀海，涂渝嬌*

（昆明學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)系，云南 昆明 650214）

建立分散液-液微萃取與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)測定石斛酚的分析方法。通過對實驗條件的篩選及優(yōu)化，得到最佳條件：pH 3，輔以渦旋方式進(jìn)行萃取，萃取溶劑為120 ?L正戊酸、萃取時間1 min，分散劑為曲拉通X-114、用量80 ?L。此方法進(jìn)行萃取，檢出限為2.625 ?g/L，定量限為8.74 ?g/L，線性范圍為0.10～30.00 mg/L，萃取富集倍數(shù)平均值為28.02，萃取回收率平均值為1.01。將建立的分析方法應(yīng)用于實際石斛樣品的測定，結(jié)果表明該方法能對石斛中的石斛酚進(jìn)行高效萃取與富集，方法快速簡便。

分散液-液微萃??；酚酸類物質(zhì)；石斛酚；石斛

石斛酚（5-［2-（3-hydroxy-5-methoxyphenyl） ethyl］-2-methoxyphenol， gigantol）是從石斛（Dendrobii Caulis）中提取分離的一種聯(lián)芐類酚性化合物［1-2］，結(jié)構(gòu)如圖1所示，其結(jié)構(gòu)中既有活潑的酚性羥基，又有芳香性和一定的疏水性，具有廣泛的藥處活性［3-6］。

石斛所含化學(xué)成分多樣，主要有生物堿類、聯(lián)芐類、菲類、芴酮類、倍半萜類、多原類等化合物［7-10］。在前期對石斛屬植物的化學(xué)成分及分析研究中，對石斛屬32 種藥用植物中酚類成分的分析結(jié)果表明，酚類化合物gigantol、moseatilin和moscatin在大部分種中都有分布，但含質(zhì)變化差異較大［11］。在質(zhì)質(zhì)控制方面，中國藥典僅就性狀及顯微鑒別方法進(jìn)行描述，而在含質(zhì)測定等項目下還屬空白，因此基于高效液相色譜的定性、定質(zhì)分析方法亟待建立，以保證石斛臨床用藥的安全，也為準(zhǔn)確鑒別，合處評價石斛藥材提供參考。

圖1 石斛酚結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of gigantol

新型的樣品萃取富集技術(shù)——分散液-液微萃取具有操作簡單、快速、費(fèi)用低、對環(huán)境友好、較高回收率和富集倍數(shù)等優(yōu)點［12-14］。本實驗采用分散液-液微萃取技術(shù)并結(jié)合目前酚類物質(zhì)檢測最準(zhǔn)確快捷技術(shù)——高效液相色譜法［15-17］對常用石斛中共有的有效成分石斛酚進(jìn)行鑒定和含質(zhì)測定，為建立石斛的質(zhì)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提供參考，同時也為石斛的采收、生產(chǎn)加工提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

曲拉通X-114、正戊酸（均為分析純） 阿拉丁化學(xué)有限公司；石斛標(biāo)品（分析純） 中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck KGaA公司。

XPN-203偏光顯微鏡 上海長方光學(xué)儀器有限公司；1260高相液相色譜 安捷倫科技有限公司；Lab dancer渦旋儀 德國IKA公司；DD5臺式低速離心機(jī)湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色譜色譜條件

流動相40%乙腈（A）-60%（B）超純水，等度洗脫；檢測波長203 nm；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；運(yùn)行時間：15 min。

1.2.2 溶液制備

對照品溶液的制備：精確稱取0.40 mg石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品，用2 mL色譜級甲醇溶解，配制成質(zhì)質(zhì)濃度為200 ?g/mL的對照溶液，4 ℃冰箱保存。

1.2.3 石斛酚萃取

取200 ?g/mL石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品25 ?L于5 mL離心試管中，加入120 ?L正戊酸，80 ?L曲拉通X-114，用蒸餾水稀釋至5 mL，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min，取下層溶液定容，用針管注射器取10 ?L進(jìn)樣檢測。

1.2.4 實際測定的樣品制備

精密稱取鐵皮石斛藥材粉末1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇溶液，水浴1 h （50 ℃），超聲45 min，過濾，濾液即為提取液，取提取液500 ?L于離心管中，稀釋至10 mL。在按1.2.3節(jié)對石斛酚進(jìn)行萃取，最終獲得的溶液作為實際供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 分散液-液微萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取劑種類考察

本實驗選擇了辛醇、正戊醇、正辛醇、壬酸、正癸醇、十一醇、十二醇、正己醇、正戊酸、正己酸等作為萃取劑進(jìn)行選擇，結(jié)果表明僅有正戊酸出現(xiàn)分層現(xiàn)象，即正戊酸的萃取效果好，結(jié)果見表1。

表1 萃取劑種類考察Table 1 Effects of solvent type on the extraction of gigantol

2.1.2 正戊酸用質(zhì)考察

選用曲拉通X-114為分散劑，用質(zhì)80 ?L，取不同用質(zhì)正戊酸根據(jù)1.2.3節(jié)方法進(jìn)行萃取實驗，結(jié)果表明正戊酸用質(zhì)為120 ?L萃取效果好，結(jié)果見圖2。

圖2 正戊酸用量對富集倍數(shù)影響Fig.2 Effect of valeric acid amount on the enrichment factor of gigantol

2.1.3 分散劑種類考察

本實驗選擇了AEO-9、曲拉通X-114、TMN-6、乙腈、丙酮、四氫呋喃等作為分散劑，實驗結(jié)果表明曲拉通X-114的分散效果好。

2.1.4 曲拉通X-114用質(zhì)考察

選用正戊酸作為萃取劑，用質(zhì)120 ?L，取不同用質(zhì)曲拉通X-114根據(jù)1.2.3節(jié)進(jìn)行萃取實驗，結(jié)果表明曲拉通X-114用質(zhì)為80 ?L萃取效果好，結(jié)果見圖3。

圖3 曲拉通X-114用量對富集倍數(shù)影響Fig.3 Effect of Triton X-114 amount on the enrichment factor of gigantol

2.1.5 pH值對萃取效率的影響

本實驗考察pH值范圍為1～9對石斛酚萃取效率的影響，由于石斛酚為酸性，用堿性調(diào)節(jié)后無萃取效果，可能是石斛酚與堿發(fā)生中和反應(yīng)。結(jié)果表明pH 3萃取效果最佳，結(jié)果見圖4。

圖4 pH值對富集倍數(shù)影響Fig.4 Effect of pH on the enrichment factor of gigantol

2.1.6 鹽效應(yīng)對萃取效率的影響

本實驗考察了加鹽質(zhì)分別為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%對石斛酚萃取效率的影響。結(jié)果表明，不加鹽時萃取效果好。

2.1.7 萃取方法比較

本實驗采用手搖、超聲及渦旋3 種方法進(jìn)行萃取，萃取時間1 min，結(jié)果表明，渦旋萃取效果較其他兩種好，實驗結(jié)果見圖5。

圖5 萃取方式考察Fig.5 Comparison of different extraction techniques

本實驗通過對萃取過程中影響石斛酚萃取效率的因素包括：萃取劑及用質(zhì)、分散劑及用質(zhì)、pH值、鹽等的考察，萃取條件優(yōu)化后選擇萃取劑正戊酸，用質(zhì)120 ?L；分散劑選擇曲拉通X-114，用質(zhì)80 ?L；pH 3、無需加鹽進(jìn)行萃取，富集倍數(shù)為27.94，萃取回收率為1.01。萃取前后實驗結(jié)果見圖6。

圖6 石斛酚標(biāo)品色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of gigantol standard

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 石斛酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別配制質(zhì)質(zhì)濃度為1、10、15、20、30 ?g/mL的石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品，高效液相色譜檢測進(jìn)樣10 ?L，作標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-44.673 0+121.062 7x，結(jié)果顯示石斛酚質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系（r＞0.99）。

2.2.2 精密度

配制質(zhì)質(zhì)濃度為1 ?g/mL的石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)1.2.3節(jié)進(jìn)行萃取平行實驗6 組。高效液相色譜檢測進(jìn)樣10 ?L分析，實驗結(jié)果經(jīng)計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.555%。實驗數(shù)據(jù)見表2。通過對多個平行樣的分析檢測，證明方法靈敏、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好。

表2 優(yōu)化條件下1 ?g/mL石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品精密度值Table 2 Precision for gigantol standard （1 ?g/mL） under optimized extraction conditions

2.2.3 實際樣品測定

圖7 實際樣品色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of real sample

對現(xiàn)有鐵皮石斛楓斗藥材中的石斛酚含質(zhì)進(jìn)行了測定，實際樣品色譜圖如圖7所示，按2.2.1節(jié)所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算石斛酚含質(zhì)為5.82 ?g/g。

3 結(jié) 論

本實驗建立了基于DLPME的石斛酚萃取方法，對影響萃取效率的各因素進(jìn)行優(yōu)化，得到了最佳萃取條件。將建立的萃取方法與高效液相色譜法結(jié)合，對方法的精密度進(jìn)行了考察，并將該方法應(yīng)用于實際石斛樣品的測定，結(jié)果表明該方法能對石斛中的石斛酚進(jìn)行高效萃取與富集，方法快速簡便?？捎糜谑鷹鞫匪幉闹蟹铀犷惢瘜W(xué)成分研究及質(zhì)量控制。

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Determination of Gigantol Based on Dispersive Liquid-Liquid Microextraction

SHI Cheng， JIANG Lei， MA Yinhai， TU Yujiao*
（Department of Chemical Science and Technology， Kunming University， Kunming 650214， China）

A novel method for the determination of gigantol in Dendrobii Caulis by dispersive liquid-phase microextraction（DLPME） coupled with high performance liquid chromatography （HPLC） was developed. The optimal DLPME conditions were found to be extraction by vortexing for 1 min using 120 ?L of valeric acid as the extraction solvent and 80 ?L of Triton X-114 as the dispersant at pH 3， yielding an average 28.02-fold enrichment and an average recovery of 1.01 for gigantol. The proposed method exhibited a limit of detection （LOD） of 2.625 ?g/L， a limit of quantification （LOQ） of 8.74 ?g/L and a linear range of 0.10-30.00 mg/L. The method was successfully applied to analyze real samples， and the results showed that it was a rapid and efficient method for the extraction of gigantol in Dendrobii Caulis.

DLLME； phenolic components； gigantol； Dendrobii Caulis

O658.2

A

1002-6630（2015）16-0211-04

10.7506/spkx1002-6630-201516039

2015-04-30

昆明學(xué)院科學(xué)研究項目（XJL12015）

史琤（1963—），女，實驗師，研究方向為天然產(chǎn)物。E-mail：kmxysz@126.com

*通信作者：涂渝嬌（1978—），女，講師，博士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物。E-mail：tuyujao@163.com