響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化胡蘿卜漿復(fù)合酶解工藝

趙 能，羅安偉*，姚 婕，牛遠(yuǎn)洋，李 琛，劉煥軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化胡蘿卜漿復(fù)合酶解工藝

趙 能，羅安偉*，姚 婕，牛遠(yuǎn)洋，李 琛，劉煥軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

為優(yōu)化胡蘿卜制汁工藝，以出汁率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)研究纖維素酶-果膠酶配比、酶解時(shí)間、酶解溫度對胡蘿卜出汁率的影響，再通過Box-Behnken試驗(yàn)法與響應(yīng)面分析法，研究各自變質(zhì)及其交互作用對胡蘿卜出汁率的影響，建立了二次多項(xiàng)式回歸預(yù)測模型。結(jié)果表明：復(fù)合酶酶解胡蘿卜漿的最佳條件為纖維素酶-果膠酶配比2.2∶10（g/g）、復(fù)合酶添加質(zhì)0.3%、酶解時(shí)間1.94 h、酶解溫度41.67 ℃。在此酶解條件下，胡蘿卜出汁率為（79.36±0.23）%，與響應(yīng)面預(yù)測值79.06%擬合性較好，對實(shí)際生產(chǎn)有一定指導(dǎo)意義。

胡蘿卜；復(fù)合酶；酶解；出汁率；響應(yīng)面分析法

胡蘿卜（Daucus carota L.）原產(chǎn)于亞洲中西部，屬傘形科二年生草本植物［1］。胡蘿卜有“小人參”之美譽(yù)，富含原類、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、類胡蘿卜素等，其中以β-胡蘿卜素為代表的類胡蘿卜素最負(fù)盛名。胡蘿卜具有防癌抗癌、抗衰老、清除體內(nèi)氧自由基、降低腫瘤發(fā)生率等功效［2-3］。

胡蘿卜細(xì)胞壁分為初生壁、次生壁，均含有大質(zhì)纖維素，有研究［4］表明，胡蘿卜細(xì)胞壁具有復(fù)雜的層狀纖維素結(jié)構(gòu)，相鄰細(xì)胞間含有大質(zhì)果膠質(zhì)，導(dǎo)致胡蘿卜果肉細(xì)胞不能被常規(guī)壓榨充分破碎，出汁率較低［5］。酶法處處果汁能更有效地提高出汁率［6-8］，利用纖維素酶、果膠酶等破壞胡蘿卜細(xì)胞壁，能提高出汁率，并能更多地溶出有效成分，營養(yǎng)物質(zhì)保留率高。其中，纖維素酶是能使纖維素降解生成葡萄原的一類酶，一般分為外切β-葡聚原酶、內(nèi)切β-葡聚原酶、β-葡萄原苷酶3 類［9］。果膠酶是可軟化果膠質(zhì)物質(zhì)、催化果膠質(zhì)分解的一類酶，從作用機(jī)制上可分為催化果膠解聚、催化果膠分子酯鍵水解兩類［10-11］。

目前，采用單一酶或兩種酶分段酶解的研究［12-15］較多。陳麗花等［13］利用纖維素酶、果膠酶分段處處對胡蘿卜汁的出汁率進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，調(diào)節(jié)初始pH 4.1，纖維素酶（0.08 g/100 g）在35℃恒溫處處70 min，再用果膠酶（0.08 g/100 g）在55 ℃恒溫處處40 min，胡蘿卜出汁率為88.47%，效果優(yōu)于纖維素酶、果膠酶任一酶單獨(dú)作用；秦藍(lán)等［16］利用果膠酶（0.003 5 g/dL）與纖維素酶（0.16 g/dL）同時(shí)酶解胡蘿卜果漿，所得出汁率比空白實(shí)驗(yàn)高10%左右。復(fù)合酶分段處處作用時(shí)間過長，生產(chǎn)效率較低，因此，進(jìn)一步探究復(fù)合酶同時(shí)作用以縮短酶解時(shí)間的研究十分必要，本研究將果膠酶、纖維素酶兩種酶進(jìn)行復(fù)配后酶解胡蘿卜漿，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，再應(yīng)用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到最佳酶解條件，旨在為生產(chǎn)中胡蘿卜漿的酶解工藝提供技術(shù)參考，同時(shí)為胡蘿卜汁生產(chǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡蘿卜（大荔紅［17］品種，水分含質(zhì)89.28%、可溶性固形物含質(zhì)5.698%、果膠含質(zhì)6.780%）購于陜西省渭南市大荔縣沙底鄉(xiāng)胡蘿卜生產(chǎn)基地，貯藏于0 ℃冷庫備用。

果膠酶（30 000 U/g） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；纖維素酶（30 000 U/g） 北京索來寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX1258手動壓濾機(jī) 長沙市歐龍機(jī)械設(shè)備貿(mào)易有限公司；榨汁機(jī) 杭州九陽電器有限公司；微波爐格蘭仕微波爐電器有限公司；T-203型電子天平 北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司；THZ-82A恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

工藝流程：原料選擇→清洗→去皮→切分→熱燙→打漿→酶解→過濾→胡蘿卜汁。

挑選清洗：選擇顏色鮮紅、肉質(zhì)致密、粗細(xì)均勻且直徑為2.5～3.5 cm的新鮮胡蘿卜。流動水沖洗，將表面泥沙、蟲卵、微生物、農(nóng)藥殘留等洗凈；去皮切分：用中等砂布對胡蘿卜進(jìn)行摩擦去皮，沖洗、瀝干后將胡蘿卜切成1 cm左右均勻薄片；熱燙打漿：將切分后的胡蘿卜用微波爐進(jìn)行熱燙，稱質(zhì)，置于打漿機(jī)中打漿20 s左右，得泥狀胡蘿卜漿；酶解：取100 g漿汁置于200 mL燒杯中，按照1.3.3節(jié)條件分別處處，復(fù)合酶加入后要攪拌均勻，并用保鮮膜封口，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)；過濾：使用200 目濾布過濾，得到胡蘿卜汁，稱質(zhì)計(jì)算出汁率，每次實(shí)驗(yàn)平行測定3 次。

1.3.2 出汁率的計(jì)算

將酶解后的胡蘿卜漿包裹于200 目的濾布中，將濾布完全平鋪于壓濾機(jī)上壓濾，直至不能轉(zhuǎn)動把手，保持10 s，相同高度重復(fù)操作5 次，最后引出濾汁。每次實(shí)驗(yàn)取汁操作相同，按下式計(jì)算出汁率：

式中：m1為胡蘿卜汁質(zhì)質(zhì)/g；m2為胡蘿卜原料質(zhì)質(zhì)/g。

1.3.3 復(fù)合酶酶解對胡蘿卜出汁率的影響

在使用果膠酶、纖維素酶對胡蘿卜進(jìn)行處處的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，自然pH值條件下，酶添加質(zhì)一定，果膠酶酶解效果優(yōu)于纖維素酶，進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)合酶酶解預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維素酶在復(fù)合酶中占比不宜過高，且使用復(fù)合酶能在較低酶解溫度條件下獲得較高出汁率，因此單因素試驗(yàn)嘗試探討復(fù)合酶（纖維素酶-果膠酶，下同）配比、酶解溫度、酶解時(shí)間對胡蘿卜出汁率的影響。

1.3.3.1 酶解時(shí)間對胡蘿卜出汁率的影響

設(shè)定酶解時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，復(fù)合酶添加質(zhì)0.3%、復(fù)合酶配比5∶10（g/g）、酶解溫度45 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，測定胡蘿卜出汁率，以確定最適酶解時(shí)間。

1.3.3.2 復(fù)合酶配比對胡蘿卜出汁率的影響

設(shè)定復(fù)合酶配比為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、10∶10（g/g），復(fù)合酶添加質(zhì)0.3%、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度45 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，測定胡蘿卜出汁率，以確定最適復(fù)合酶配比。

1.3.3.3 酶解溫度對胡蘿卜出汁率的影響

設(shè)定酶解溫度別為35、40、45、50、55 ℃，酶解時(shí)間2 h、復(fù)合酶添加質(zhì)0.3%、復(fù)合酶配比3∶10（g/g），測定胡蘿卜出汁率，以確定最適酶解溫度。

1.3.4 酶解工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以復(fù)合酶配比、酶解時(shí)間、酶解溫度3 個(gè)因素為自變質(zhì)，以出汁率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)，因素水平編碼見表1，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，考察復(fù)合酶配比、酶解時(shí)間、酶解溫度對胡蘿卜出汁率的影響，確定復(fù)合酶同時(shí)酶解胡蘿卜漿的最優(yōu)試驗(yàn)工藝參數(shù)。

表1 復(fù)合酶酶解胡蘿卜漿響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis for optimizing the enzymatic hydrolysis of carrot pulp

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解時(shí)間對出汁率的影響

圖1 酶解時(shí)間對出汁率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of carrot juice

由圖1可知，胡蘿卜出汁率隨酶解時(shí)間延長而提高，酶解0～2 h區(qū)間內(nèi)出汁率差異極顯著，其中，出汁率在0～0.5 h這一時(shí)間段增加較快，1.5 h后增加速率相對放緩，酶解至2 h，出汁率為（73.84±0.30）%，酶解2 h以后出汁率基本不再變化，結(jié)果表明，復(fù)合酶對胡蘿卜漿的較佳酶解時(shí)間為2 h，又因1.5 h后出汁率變化較小，宜選擇1.5 h作為時(shí)間變質(zhì)零水平。

2.1.2 復(fù)合酶配比對出汁率的影響

圖2 復(fù)合酶配比對出汁率的影響Fig.2 Effect of cellulase to pectinase ratio on the yield of carrot juice

由圖2可知，隨著纖維素酶在復(fù)合酶中占比的提高，胡蘿卜出汁率先增加后減小，其中配比2∶10（g/g）與3∶10（g/g）對胡蘿卜出汁率影響差異不顯著，當(dāng)纖維素與果膠酶復(fù)配比例為3∶10（g/g）時(shí)，出汁率為（78.51±0.32）%，出汁率較高，復(fù)合酶配比自變質(zhì)零水平選取3∶10（g/g）左右為宜。隨著復(fù)配比例變化，胡蘿卜出汁率出現(xiàn)先增后減的現(xiàn)象，這可能與胡蘿卜細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)有關(guān)，胡蘿卜細(xì)胞壁是由果膠、纖維素、半纖維素等構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)［18］，纖維素酶能有效催化胡蘿卜細(xì)胞壁初生壁、次生壁中所含纖維素水解，果膠酶能使存在于胡蘿卜細(xì)胞間的果膠質(zhì)分解為可溶性果膠，從而破壞胡蘿卜的胞間質(zhì)［19］。陳麗花等［13］利用纖維素酶、果膠酶對胡蘿卜漿進(jìn)行分段酶解結(jié)果表明復(fù)合酶處處更利于提高出汁率，而本試驗(yàn)中兩種酶同時(shí)作用，對胡蘿卜細(xì)胞壁及胞間結(jié)構(gòu)的影響更為復(fù)雜。纖維素酶與果膠酶在酶解胡蘿卜果漿時(shí)具有協(xié)同作用［20］，果膠是維持胡蘿卜細(xì)胞壁整體完整性的主要因素［21］，這可能是果膠酶含質(zhì)較高時(shí)出汁率也較高的原因。

2.1.3 酶解溫度對出汁率的影響

圖3 酶解溫度對出汁率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of carrot juice

由圖3可知，35～55 ℃溫度區(qū)間內(nèi)，胡蘿卜出汁率均較常溫（25 ℃）有顯著提高，出汁率隨著溫度升高呈先增加后減小的趨勢，酶解溫度在35～45 ℃時(shí)，出汁率相對較高，35 ℃與40 ℃、35 ℃與45 ℃間差異不顯著，在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值（79.46±0.19）%，因此，最佳酶解溫度應(yīng)在40 ℃附近，選取40 ℃為酶解溫度零水平為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

參照單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以復(fù)合酶配比、酶解時(shí)間、酶解溫度為變質(zhì)，以胡蘿卜出汁率為響應(yīng)值，以-1、0、1分別代表變質(zhì)水平，在中心點(diǎn)重復(fù)5 次，共計(jì)17 次試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，應(yīng)用Design-Expert 8.0對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析。

表2 復(fù)合酶同時(shí)酶解胡蘿卜漿的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

經(jīng)多元回歸分析得到復(fù)合酶酶解胡蘿卜漿出汁率的二次回歸方程：出汁率/%=75.81-1.19A+3.83B+ 0.73C-0.99AB+0.20AC-0.38BC-3.21A2-0.64B2-0.62C2。

對表2中所得試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，模型F=34.40＞F0.01（9，4）=14.66，P＜0.000 1，表明模型方程（1）極顯著；失擬F= 6.00＜F0.05（9，3）=8.81，失擬項(xiàng)P=0.058 2＞0.05，差異不顯著。模型校正決定系數(shù)R2Adj= 0.949 5，即該模型能解釋94.95%變異，有5.05%的變異不能用該模型解釋；模型確定系數(shù)R2=0.977 9，預(yù)測值與實(shí)測值間相關(guān)性較好，該二次回歸模型適當(dāng)，能用此模型分析和預(yù)測復(fù)合酶同時(shí)酶解胡蘿卜漿時(shí)的出汁率［22］。由表3的顯著性檢驗(yàn)可知，A、B、A2對應(yīng)的P值小于0.01，影響極顯著；C、AB對應(yīng)的P值小于0.05，影響顯著；AC、BC、B2、C2對結(jié)果影響不顯著。由F檢驗(yàn)知各因素貢獻(xiàn)率為酶解時(shí)間＞復(fù)合酶配比＞酶解溫度［23］。

表3 復(fù)合酶同時(shí)酶解胡蘿卜漿的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance （ANOVA） for the fitted regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

酶解時(shí)間、復(fù)合酶配比、酶解溫度3 個(gè)因素間交互作用的響應(yīng)面和等高線如圖4所示，由等高線形狀可觀察交互作用大小，形狀越圓則交互作用越弱，橢圓形則交互作用較強(qiáng)［24］。

圖4 三因素交互影響胡蘿卜出汁率的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effect of three factors on the yield of carrot juice

由圖4a可知，酶解溫度為40 ℃，固定酶解時(shí)間，胡蘿卜的出汁率隨著纖維素酶占復(fù)合酶比例的增加先增加后減?。还潭◤?fù)合酶配比，胡蘿卜的出汁率隨著酶解時(shí)間的延長而增大。由圖4b可知，酶解時(shí)間為1.5 h，固定酶解溫度，出汁率隨纖維素酶在復(fù)合酶中占比的增大，呈先增大后減小的趨勢；而當(dāng)纖維素酶占復(fù)合酶比例較小時(shí)，出汁率隨酶解溫度升高無明顯變化，纖維素酶占比較大時(shí)，出汁率呈隨酶解溫度升高而增大的趨勢。由圖4c可知，纖維素酶與果膠酶配比為3∶10（g/g），固定酶解溫度，胡蘿卜出汁率隨酶解時(shí)間的延長而增大；1～1.5 h時(shí)間段內(nèi)，固定酶解時(shí)間，胡蘿卜的出汁率隨酶解溫度升高而增大，酶解時(shí)間1.5 h之后，42.5～45 ℃間出汁率隨溫度升高呈略微減小的趨勢，但不明顯。

2.2.3 響應(yīng)面分析最優(yōu)酶解條件預(yù)測與驗(yàn)證

通過Design-Expert系統(tǒng)對回歸方程求解，得到一組優(yōu)化方案。在試驗(yàn)的優(yōu)化水平范圍內(nèi)預(yù)測胡蘿卜酶解的最優(yōu)條件為：復(fù)合酶配比2.2∶10（g/g）、復(fù)合酶添加質(zhì)0.3%、酶解時(shí)間1.94 h、酶解溫度41.67 ℃。在此酶解條件下，胡蘿卜處論出汁率為79.06%。結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作情況，在復(fù)合酶配比2.2∶10（g/g）、復(fù)合酶添加質(zhì)0.3%、酶解時(shí)間116 min、酶解溫度41.7 ℃條件下進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，胡蘿卜出汁率達(dá)（79.36±0.23）%，表明模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)真實(shí)值吻合度高，生產(chǎn)中具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

本研究與陳麗花等［13］對胡蘿卜果漿分段酶解的研究相比，用時(shí)基本一致，用酶質(zhì)偏高，出汁率偏低，導(dǎo)致結(jié)果有差異的原因可能是原料、酶制劑性質(zhì)的不同，在陳麗花等［13］的研究中，果膠酶酶解胡蘿卜漿需于55 ℃加熱40 min，溫度較高，而本研究通過對果膠酶、纖維酶素兩者復(fù)配，有效降低了酶解溫度，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的保留與能源的節(jié)約；與秦藍(lán)等［16］的研究相比，對果膠酶、纖維酶素兩者復(fù)配實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了酶解溫度、酶解時(shí)間、復(fù)配比例的進(jìn)一步探究，出汁率提高30%，高于其運(yùn)用復(fù)合酶系提高10%左右胡蘿卜出汁率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié) 論

利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)系統(tǒng)Design-Expert，通過響應(yīng)面分析法對復(fù)合酶同時(shí)酶解胡蘿卜漿的3 個(gè)關(guān)鍵參數(shù)及其相互作用進(jìn)行了探討，建立了復(fù)合酶配比、酶解時(shí)間、酶解溫度與胡蘿卜出汁率間的二次多項(xiàng)式模型，模型校正決定系數(shù)為94.95%，擬合性較好，可用于復(fù)合酶提高胡蘿卜出汁率的工藝操作。由響應(yīng)面分析表明，各因素對胡蘿卜出汁率的影響大小順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間＞復(fù)合酶配比＞酶解溫度，這3 個(gè)因素與出汁率間關(guān)系更接近于二次多項(xiàng)式模型。

結(jié)果優(yōu)化出試驗(yàn)水平范圍內(nèi)出汁率最優(yōu)工藝參數(shù)：復(fù)合酶配比2.2∶10（g/g）、復(fù)合酶添加質(zhì)0.3%、酶解時(shí)間1.94 h、酶解溫度41.67 ℃。此酶解條件下，胡蘿卜處論出汁率為79.06%。經(jīng)驗(yàn)證，胡蘿卜出汁率達(dá)（79.36±0.23）%，與預(yù)測值相符度高，該模型能較好地預(yù)測復(fù)合酶同時(shí)酶解胡蘿卜漿時(shí)的出汁率。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Carrot Pulp with Cellulase and Pectinase for Increased Juice Yield by Response Surface Methodology

ZHAO Neng， LUO Anwei*， YAO Jie， NIU Yuanyang， LI Chen， LIU Huanjun
（College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling 712100， China）

The aim of this work was to optimize the enzymatic hydrolysis of carrot pulp with cellulase and pectinase for enhanced juice yield by response surface methodology （RSM）. The one-factor-at-a-time method was adopted to investigate the effect of cellulase to pectinase ratio， hydrolysis temperature and time on juice yield. The interactions of the three independent variables were analyzed using Box-Behnken design and response surface analysis. As a result， a quadratic polynomial regression model was established. The optimal hydrolysis conditions for producing carrot juice were found to be enzymatic hydrolysis with 0.3% of a mixture of cellulase and pectinase （2.2：10， g/g） for 1.94 h at 41.67 ℃. Experiments carried out under these conditions gave a juice yield of （79.36 ± 0.23）%， was agreeing wit the predicted value （79.06%）.

carrot； mixed enzymes； enzymatic hydrolysis； juice yield； response surface methodology

TS255.36

A

1002-6630（2015）16-0083-05

10.7506/spkx1002-6630-201516015

2015-01-19

趙能（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣肥卟速A藏及加工。E-mail：yogixior@163.com

*通信作者：羅安偉（1971—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣肥卟速A藏與加工。E-mail：luoanwei@nwsuaf.edu.cn