動物飼料中常用磺胺藥物的檢測方法

薛瑞婷 李 棟 王改芳

(呂梁學(xué)院生命科學(xué)系,山西呂梁 033000)

動物飼料中常用磺胺藥物的檢測方法

薛瑞婷 李 棟 王改芳

(呂梁學(xué)院生命科學(xué)系,山西呂梁 033000)

作者對動物飼料中10種常用磺胺藥物采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測，對樣品經(jīng)提取、凈化、稀釋及分離后對其進(jìn)行質(zhì)譜分析，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行特征母-子離子對信號采集。10種磺胺類藥物保留時間重現(xiàn)性好，峰形也處于理想的狀態(tài)；且配合飼料的總離子流色譜圖中背景基線穩(wěn)定，未出現(xiàn)干擾的狀況。除此之外，10 種磺胺類藥物的平均回收率在70%～92%之間，且日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在15%以內(nèi)，這說明高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適用于飼料多磺胺組的分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法采用高效液相色譜系統(tǒng)與三級四級桿串聯(lián)質(zhì)譜組成，離心機(jī)、真空氮氣吹干儀、去離子水發(fā)生器以及12通道半自動固相萃取裝置。10種磺胺主要包括：C10H10N4O2S、C11H12N4O3S、C11H12N4O3S、磺胺5-甲氧嘧啶、C11H13N3O3S、C11H12N4O3S、磺胺吡啶、C12H14N4O4S、磺胺二甲基嘧啶、C14H11N4NaO2S；所有磺胺的純度均在95%-99%之間。除此之外還包括甲醇、劑量為500mg的6mLHLB固相萃取柱；實驗過程中的用水均為去離子水。

采用甲醇將10種磺胺進(jìn)行混合，其中，磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉的濃度配置在50mg/L，其余8種磺胺的濃度配置為100mg/L，然后將已經(jīng)配置好的溶液存放與于溫度在-18℃的環(huán)境下進(jìn)行避光存放。最后貯備劑量為1.0mL的溶液，采用甲醇將溶液定容至劑量為 100mL后將其放在溫度為0～4℃環(huán)境中保存4w，逐級稀釋工作溶液后做到現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取樣品及凈化

工作人員應(yīng)該稱取劑量為5g的飼料樣品，將其研磨混勻后將其放置于離心管中，然后在存有飼料樣品的離心管中加入劑量為20mL的甲醇以及濃度為0.1mmol/L的鹽酸，對溶液進(jìn)行提取，充分地將溶液進(jìn)行時間1min左右的渦動混合后將其置于常溫水浴中，然后采用超聲提取3次，30s/次。其次將超聲提取后的溶液靜置5min后在4 000 r/min下進(jìn)行長達(dá)10 min的離心，然后取劑量為2.0mL的上清液，加入劑量為3.0mL的水進(jìn)行渦動混勻后，確保其實現(xiàn)自然的流速過柱。依次采用 5mL的水及濃度為0.1mmol/L的鹽酸洗滌SPE柱，在真空下1min抽干柱中殘留液體。采用劑量為5.0mL的甲醇溶液對柱中存在的結(jié)合物進(jìn)行洗脫，然后確保液體流動的速度控制在1mL/min內(nèi)。除此之外，工作人員需要收集洗脫液，并且在溫度為40℃左右環(huán)境的水浴下采用真空氮氣吹干儀來對溶劑進(jìn)行蒸發(fā)。然后工作人員采用適量的流動相來溶解殘渣，將其經(jīng)過0.45μm的水相濾膜過濾后對清液進(jìn)行測定。工作人員在樣品加標(biāo)實驗的過程中，稱取適量的樣品后在樣品中加入磺胺類藥物，最后將其放置在室溫的環(huán)境下，放置10min后在溶液中加入提取溶液。

1.2.2 液質(zhì)聯(lián)用

色譜條件：工作人員應(yīng)當(dāng)設(shè)置堿性反相色譜柱參數(shù)為15cm×2.1mmi.d.；并且將柱溫的溫度控制在35℃左右；而流動相的濃度應(yīng)當(dāng)控制在1mmol/L左右，pH值為4.6；流速控制在0.3mL/ min；進(jìn)樣量為20μL。梯度洗脫的步驟為：在0.01min時采用濃度為80%的醋酸銨溶液，在8.0min內(nèi)線性增長至濃度為52%的甲醇，然后在11min內(nèi)線性降至濃度為50%的醋酸銨溶液，對其進(jìn)行系統(tǒng)平衡。

質(zhì)譜參數(shù)：工作人員應(yīng)該將離子源溫度設(shè)置為500℃左右，電力電壓設(shè)定為4500V；并且需要將霧化氣、氣簾氣以及加熱輔助氣的流量設(shè)置為8.0L/min。采用MRM為監(jiān)測模式，其中SD的Q1為m/z251.1，SPD的Q1為250.1，SM1的Q1為265.1，SMZ的Q1為254.2，SDM的Q1為311.0，SQX的Q1為301.2；而相應(yīng)的特征碎片離子Q3為m/z156，108，92；SM、SMP以及SMM的Q1為m/z281.2，SM的Q3為m/z156，SMP的Q3為108以及SMM的Q3為92；SM1的Q1 為m/z279.1，Q3為m/z156，186。③液質(zhì)聯(lián)用測定：將磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液采用流動相逐級稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，與樣品溶液依次等體積進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取、凈化及分離

從樣品提取、凈化及分離可以得出，動物飼料中的脂肪、蛋白以及含量較低以及磺胺類藥物的弱堿性相關(guān)特點（如表1所示）。我們在本次實驗過程中，工作人員主要對樣品的提取主要采用的是酸性緩沖液的方式，然后在樣品中加入適量的有機(jī)物質(zhì)。但我們在實驗的過程中考慮到質(zhì)譜檢測器具有較強(qiáng)選擇性的特點，因此實驗對提取液采用的凈化方式為HLB柱。

圖1可以看出，10種磺胺類藥物在時間為11min內(nèi)均得到了較好的分離，并且具有較好的峰形。除此之外對各種磺胺類藥物的同分異構(gòu)體可結(jié)合保留時間進(jìn)行定性。并且配合飼料的總離子流色譜圖中背景基線穩(wěn)定，未出現(xiàn)干擾的狀況。10 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品混合物的總離子流色譜圖如圖1所示：

圖1 10 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品混合物的總離子流色譜圖

2.2 參數(shù)設(shè)定

在本次試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)色譜流動相的醋酸銨濃度在10mmol/L以上時，將會明顯地抑制電離反應(yīng)。因此，在實驗的過程中應(yīng)該在盡可能地降低流動相中的鹽濃度，如此便能有效地確保磺胺類藥物在濃度為1mmol/L的醋酸銨緩沖鹽中達(dá)到足夠的靈敏度。工作人員可以采用串聯(lián)質(zhì)譜MRM信號的采集方式對動物飼料中多磺胺類藥物進(jìn)行分析，分別進(jìn)行Q1母離子掃描以及Q3子離子全掃描，如此便能有效地確定MRM的特征，并根據(jù)此結(jié)果對離子進(jìn)行診斷。

表1 磺胺類藥物產(chǎn)生的離子碎片

根據(jù)表1我們可以得出，10 種磺胺類藥物具有共同的碎片離子157及109，它們是相對豐度較高的離子對。在選擇MRMQ1/Q3對離子進(jìn)行診斷的過程中，需要盡可能地避開背景對檢測過程和檢測結(jié)果造成的干擾。如 SM2與儀器管路中常見的背景離子鄰苯二甲酸酯的分子離子峰恰好相同，均為280，且實驗表明很多水產(chǎn)養(yǎng)殖用飼料也含有 279/204 的背景離子對信號。因此磺胺類藥物的側(cè)鏈R基團(tuán)不同時，產(chǎn)生共同碎片的最優(yōu)碰撞能量也將存在差異。在MRM模式下磺胺類藥物特征診斷離子如表2所示：

表2 MRM模式下磺胺類藥物特征診斷離子

2.3 回收率及精密度

當(dāng)磺胺類藥物添加水平為1.0mg/kg時，經(jīng)過提取、MHN柱凈化等過程后，10 種磺胺類藥物的平均回收率在70%～92%之間，且日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在15%以內(nèi)，因此適用于飼料多磺胺組的分析。回收率及精密度如表3所示：

表3 回收率及精密度[n=5，（x±s）]

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薛瑞婷（1988-），女，碩士研究生，助教，動物營養(yǎng)。

項目名稱：呂梁學(xué)院校內(nèi)基金。ZRXN201411 鉛對蟾蜍蝌蚪生長發(fā)育的毒性效應(yīng)。