李琦軍，常軍英，吳永波，邢兆國*，周紅艷，賈東昭

(1.河北省石家莊市第三醫(yī)院創(chuàng)傷一科，河北 石家莊 050011；

2.河北省石家莊市公安局法醫(yī)損傷檢驗鑒定室，河北 石家莊 050011)

·論著·

神經(jīng)肽Y對小神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)和生成TNF-α的影響及其作用機制

李琦軍1，常軍英1，吳永波2，邢兆國1*，周紅艷1，賈東昭1

(1.河北省石家莊市第三醫(yī)院創(chuàng)傷一科，河北 石家莊 050011；

2.河北省石家莊市公安局法醫(yī)損傷檢驗鑒定室，河北 石家莊 050011)

[關鍵詞]神經(jīng)肽-Y；小神經(jīng)膠質(zhì)細胞；腫瘤壞死因子α

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.029

小膠質(zhì)細胞是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞。正常狀態(tài)下，小膠質(zhì)細胞處于靜息狀態(tài)，當內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化時迅速被激活，激活后的小膠質(zhì)細胞能夠釋放白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等大量生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)過度釋放并積聚于中樞神經(jīng)系統(tǒng)會導致神經(jīng)元損傷[1-3]。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)是一種多肽類物質(zhì)，廣泛分布于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)。最近Ferreira等[4]的研究表明，NPY可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所致的小鼠小膠質(zhì)細胞N9細胞株的激活，降低其吞噬能力，減少IL-1β生成。但NPY對體外培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞生物活性的調(diào)節(jié)，以及與其相關的細胞因子生成的關系還未見報道。本研究旨在探討NPY對體外培養(yǎng)的原代大鼠皮層小膠質(zhì)細胞的生物活性和小膠質(zhì)細胞來源的TNF-α生成的影響及其作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物24 h內(nèi)新生雄性SD大鼠30只[清潔級，河北省實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(冀)2013-1-03]。

1.2主要試劑小鼠單克隆抗體IBA-1 (美國Sigma公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗小鼠IgG(美國Proteintech公司)；LPS(美國Sigma公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEMF12培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；BIBP3226(美國Tocris Bioscience公司)；NPY(美國ENZO公司)；ELISA試劑盒(中國Bio-Swamp公司)； Trizol(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒 (美國Promega公司)；RNA酶抑制劑(RNasin) (美國Promega公司)；PCR擴增試劑盒(美國Promega公司)；隨機引物(美國Promega公司)。

1.3小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)堆24 h內(nèi)新生大鼠無菌環(huán)境下開顱取腦，剝除腦膜及血管，取部分大腦皮質(zhì)，剪碎后用0.125%胰蛋白酶37 ℃消化15 min，終止消化，反復吹打成懸液，1 000 r/min離心5 min后過濾，棄上清，在沉淀物中加入膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液，膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清，1 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，制成細胞懸液，接種于250 mL培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。第2天全量換液1次，以后每3 d更換1/2體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第14天，細胞充分分層生長后，置于37 ℃恒溫搖床中180 r/min振搖2 h，收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清，用DMEM/F12全培養(yǎng)基吹打成細胞懸液，將細胞調(diào)至約1×105/mL，種植到預先鋪好多聚賴氨酸的6孔板內(nèi)，每孔3 mL。在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置30 min后完全換液1次，去除少突膠質(zhì)細胞，加入 DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3~5 d。

1.4形態(tài)學觀察分離純化好的小膠質(zhì)細胞分別以1×104個細胞/皿接種于3個預先放置經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的3.5 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)3 d后換新鮮無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h使細胞同步化，然后分別更換為無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液、含LPS(終濃度為100 μg/L)的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液和先加入NPY(終濃度為1 μmol/L)0.5 h后再加入 LPS (終濃度為100 μg/L)的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6 h后取出蓋玻片，以IBA-1為一抗，行免疫細胞化學染色，熒光顯微鏡下觀察原代大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞的形態(tài)。

1.5小膠質(zhì)細胞分組及處理方法將分離純化好的小膠質(zhì)細胞以2×104個細胞/孔接種于預鋪多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板用于TNF-α蛋白檢測，以5×105個細胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板用于TNF-α mRNA的檢測。培養(yǎng)3 d后換新鮮無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h使細胞同步化，然后將細胞分為Control組、LPS組、NPY+LPS組、NPY組和BIBP3226+NPY+LPS組，每組3個樣本。Control組細胞以無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育6 h，LPS組細胞以含終濃度為100 μg/L LPS的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育6 h，NPY+LPS組細胞先以含NPY (終濃度為1 μmol/L)的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育0.5 h，然后加入LPS(終濃度為100 μg/L)繼續(xù)孵育6 h。BNPY組細胞以含NPY (終濃度為1 μmol/L) 無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育6 h。BIBP3226+NPY+LPS組細胞先用含NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226 (終濃度為1 μmol/L)的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育0.5 h，再加入終濃度為1 μmol/L的NPY孵育0.5 h，最后加入終濃度100 μg/L的LPS繼續(xù)孵育6 h。

1.6NPY和LPS處理后的小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中TNF-α蛋白含量的檢測取各組小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液，離心后采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中 TNF-α蛋白含量。

1.7NPY和LPS處理后的小膠質(zhì)細胞中TNF-α mRNA表達水平的檢測采用實時熒光定量PCR法檢測上述各組小膠質(zhì)細胞中的TNF-α mRNA表達水平。小膠質(zhì)細胞加入Trizol(1 mL/孔)，吹打后移至去核酶的離心管中，靜置5 min。每管加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s，靜置5 min。12 000 r/min離心15 min，把上層無色液體移到新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，管底可見羽毛狀白色沉淀物，完全棄去上清。加入1 mL 75%乙醇(DEPC水配置)，洗滌沉淀。4℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清。靜置晾干3~5 min，加入20~30 μL DEPC水充分溶解RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳證實RNA完整性較好，無污染。紫外分光光度計檢測RNA濃度。上海生工生物公司合成引物。TNF-α引物序列為正義鏈引物:5′-TGCCTCAGCCTCTTCTCATT-3′，反義鏈引物:5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′，擴增長度 208 bp；GAPDH引物序列正義鏈引物:5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，反義鏈引物:5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′，擴增長度120 bp。實時PCR反應中反轉(zhuǎn)錄反應體系為總 RNA 8 μL，隨機引物 1 μL，2×ES 混合物10 μL，RT/RI酶體系 1 μL，總體積20 μL。擴增體系為2×UltraSYBR 混合物(含 ROX)10 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，cDNA 8 μL，總體積20 μL。RT-PCR反應程序參數(shù)：預變性 95 ℃ 10 min；變性 95 ℃ 15 s，退火 58 ℃ 20 s，延伸 72 ℃ 27 s，40個循環(huán)。用ABI 7300 Real-Time PCR System(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)檢測并計算目的基因表達量與內(nèi)參GAPDH比較的相對值(RQ值)。

2結(jié)果

2.1經(jīng)LPS和NPY處理后體外培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學變化Control組細胞呈分枝狀外觀，胞體較小，有細長的突起，細胞表達IBA-1。LPS組小膠質(zhì)細胞處于活化狀態(tài)，胞體變?yōu)閳A形和阿米巴狀，突起回縮，IBA-1染色加深。NPY+LPS組小膠質(zhì)細胞大部分為非活化狀態(tài)，成多角形，有長的突起，IBA-1染色陽性，但比LPS組熒光強度明顯減弱。

2.2不同培養(yǎng)液孵育小膠質(zhì)細胞后培養(yǎng)液中TNF-α蛋白含量的變化各組小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)6 h后，LPS組與BIBP3226+NPY+LPS組中TNF-α的含量顯著高于Control組(P<0.05)，LPS組與BIBP3226+NPY+LPS組之間差異無統(tǒng)計學意義；LPS+NPY組與LPS組相比，培養(yǎng)液中TNF-α含量顯著降低(P<0.05)；BIBP3226+NPY+LPS組與LPS+NPY組相比，培養(yǎng)液中TNF-α的含量顯著增高(P<0.05)；NPY組與Control組差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.3不同培養(yǎng)液孵育小膠質(zhì)細胞后小膠質(zhì)細胞中TNF-α mRNA、水平的變化各組小膠質(zhì)細胞6 h后，LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組小膠質(zhì)細胞的TNF-α mRNA表達水平顯著高于Control組(P<0.05)，LPS組與BIBP3226+NPY+LPS組差異無統(tǒng)計學意義；與LPS組相比，LPS+NPY組小膠質(zhì)細胞中的TNF-α mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)；與LPS+NPY組相比，BIBP3226+NPY+LPS組小膠質(zhì)細胞中的TNF-α mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)；NPY組與Control組差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1　各組小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量及小膠質(zhì)細胞中TNF-α mRNA表達水平

*P<0.05與Control組比較#P<0.05與LPS組比較△P<0.05與LPS+NPY組比較☆P<0.05與NPY組比較(LSD-t檢驗)

3討論

近年來免疫在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用受到越來越多的關注。小膠質(zhì)細胞廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在免疫功能調(diào)節(jié)方面起著重要作用。很多資料顯示小膠質(zhì)細胞激活和中樞神經(jīng)系統(tǒng)很多疾病有關，如阿爾茨海默病、帕金森綜合征、腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變[5-7]。當中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病理變化時，小膠質(zhì)細胞能夠迅速作出反應，由靜止狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，胞體變大，成阿米巴狀，特異性標志產(chǎn)物增加，吞噬能力增強。小膠質(zhì)細胞活化后產(chǎn)生大量細胞因子等生物活性物質(zhì)，如IL-1β、TNF-α、一氧化氮等，這些物質(zhì)的大量積聚會對神經(jīng)元產(chǎn)生毒害作用，這可能是小膠質(zhì)細胞活化后導致神經(jīng)元損傷的重要途徑之一。TNF-α是最常見的損傷性細胞因子，也是小膠質(zhì)細胞激活后釋放的前炎癥因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。

NPY全名神經(jīng)肽酪氨酸，是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)肽，與癲癇、學習、記憶、攝食和內(nèi)分泌都有著密切關系。NPY 通過與不同的受體結(jié)合在體內(nèi)發(fā)揮不同的作用，NPY 受體都屬于 G 蛋白的偶聯(lián)受體，在人體內(nèi)包括Y1、Y2、Y3、Y4、Y5 5種亞型。其Y1受體與機體免疫功能的調(diào)節(jié)有密切關系，NPY通過其Y1受體影響細胞遷移、細胞因子釋放、抗體產(chǎn)生等多個方面[8-10]。周江睿[11]的研究顯示，NPY對炎癥因子的調(diào)節(jié)具有雙面性，一方面，NPY能夠抑制腹腔巨噬細胞釋放炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6 和前列腺素B2，另一方面，NPY能夠促進腹腔巨噬細胞晚期炎癥因子HMGB1 的分泌。最近Ferreira等[12]的研究表明，小鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細胞株N9細胞表達NPYY1受體，NPY可以抑制LPS所致N9細胞的激活，減少IL-1β、一氧化氮的生成；NPY還能抑制N9細胞的吞噬作用和遷移能力，當阻斷NPY Y1受體后，這種抑制作用消失。但NPY對原代培養(yǎng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞的影響還未見報道，如果NPY能夠降低原代培養(yǎng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞的免疫活性，減少TNF-α等炎癥因子的生成，那么它有可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)通過神經(jīng)-免疫途徑起到保護神經(jīng)元的作用。本研究采用LPS為小膠質(zhì)細胞的激活劑，LPS處理小膠質(zhì)細胞 6 h后，小膠質(zhì)細胞處于明顯的活化狀態(tài)，細胞體積增大，突觸回縮，由分支狀變?yōu)閳A形、梭形或者阿米巴狀，特征性標志物IBA-1免疫染色加深，小膠質(zhì)細胞的免疫活性也隨之增強，小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量與小膠質(zhì)細胞細胞中TNF-α mRNA表達水平均明顯增高，與Conreol組差異有統(tǒng)計學意義。加入NPY后能夠明顯抑制LPS對小膠質(zhì)細胞的激活作用，使大部分小膠質(zhì)細胞處于非活化狀態(tài)，降低了小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量和小膠質(zhì)細胞細胞內(nèi)的TNF-α mRNA表達水平，使用BIBP3226阻斷NPY Y1受體后這種抑制作用完全消失，說明NPY有可能通過Y1受體起到降低小膠質(zhì)細胞的免疫活性、減少小膠質(zhì)細胞來源的TNF-α產(chǎn)生。NPY處理非活化的小膠質(zhì)細胞后，培養(yǎng)液中TNF-α含量及小膠質(zhì)細胞細胞內(nèi)的TNF-α mRNA水平均未發(fā)生明顯變化，說明NPY對靜止期的小膠質(zhì)細胞影響不大。本研究結(jié)果表明，NPY對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的小膠質(zhì)細胞的免疫活性有調(diào)節(jié)作用，NPY能下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細胞的免疫活性，抑制TNF-α的產(chǎn)生，這種作用可能是通過其Y1受體實現(xiàn)的，這為NPY以小膠質(zhì)細胞為靶點治療與免疫有關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實驗依據(jù)。

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(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2014-07-03；[修回日期]2014-08-04

[作者簡介]李琦軍(1972-)，男，河北正定人，河北省石家莊市第三醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事創(chuàng)傷骨科疾病診治研究。

*通訊作者

[中圖分類號]R322.8

[文獻標志碼]B

[文章編號]1007-3205(2015)04-0463-04

[摘要]目的探討神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)對原代小神經(jīng)膠質(zhì)細胞生物活性及生成腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的影響及其作用機制。方法培養(yǎng)原代大鼠皮層小膠質(zhì)細胞，將細胞分為Control組、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組、NPY+LPS組、NPY組和BIBP3226+NPY+LPS組，分別用無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液、含LPS的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液、含NPY和LPS的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液、含NPY的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液和含BIBP3226、NPY和LPS無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)孵育細胞6 h。經(jīng)免疫細胞化學熒光染色后，顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學變化。ELISA方法檢測培養(yǎng)液中TNF-α蛋白含量，RT-PCR方法檢測小膠質(zhì)細胞中TNF-α mRNA表達水平。結(jié)果LPS組TNF-α的含量及細胞中TNF-α mRNA表達水平顯著高于Control組(P<0.05)，小膠質(zhì)細胞處于活化狀態(tài)；LPS+NPY組與LPS組相比，TNF-α蛋白和mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，小膠質(zhì)細胞活化水平降低；BIBP3226+NPY+LPS組與LPS+NPY組相比，TNF-α蛋白和mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)；LPS組與BIBP3226+NPY+LPS組差異無統(tǒng)計學意義；NPY組與Control組差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論NPY可以降低小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生物活性，抑制其生成TNF-α，作用機制可能與NPY Y1受體有關。