陳阿虹，劉杰，許文,2，李煌，陳嫻雯，蘇世德，褚克丹，徐偉

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建福州350122）

RRLC-MS／MS法測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸含量

陳阿虹1，劉杰1，許文1,2，李煌1，陳嫻雯1，蘇世德1，褚克丹1，徐偉1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建福州350122）

目的采用快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（RRLC-MS／MS）測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸含量。方法采用RRLC-MS／MS法，以極性AQ-C18柱為色譜柱，以乙腈-0.1%甲酸水（5∶95）為流動(dòng)相。質(zhì)譜采用電子噴霧離子源（ESI）進(jìn)行離子化，正離子模式下采集，選擇以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）對這2種氨基酸的母離子及子離子進(jìn)行檢測，三重四級桿質(zhì)譜進(jìn)行定量分析。結(jié)果γ-氨基丁酸與瓜氨酸在0.265 0～10.60 μg／mL和0.019 6～9.800 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，平均樣品加樣回收率分別為99.4%和102.4%，RSD%分別為2.24%和1.85%。結(jié)論RRLC-MS／MS法測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸的含量，方法簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，重復(fù)性好。

栝樓桂枝顆粒；γ-氨基丁酸；瓜氨酸；RRLC-MS／MS；含量測定

栝樓桂枝湯來源于東漢末年張仲景的《金匱要略》［1］，由天花粉、白芍、桂枝、生姜、甘草及大棗6味藥組成。目前，源于栝樓桂枝湯的顆粒劑經(jīng)新藥申報(bào)批準(zhǔn)為福建省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑（批準(zhǔn)文號：閩2013S0001），在臨床上用于腦卒中后康復(fù)治療［2-3］，尤其對腦卒中后軀體痙攣患者療效顯著，現(xiàn)代藥理研究［4-11］表明栝樓桂枝湯具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。

處方中君藥天花粉含有大量氨基酸，其中γ-氨基丁酸和瓜氨酸是主要的具有生理調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)。2010年版中國藥典僅用瓜氨酸對天花粉進(jìn)行定性鑒別，并無定量鑒別方法。本文采用RRLCMS／MS法同時(shí)測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸的含量，為建立栝樓桂枝顆粒的質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 6410快速液相色譜與串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；乙腈（德國Merke公司）；Millipore超純水（美國Millipore公司）；CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）；高速離心機(jī)（HC-2068，安徽中佳科學(xué)儀器有限公司）；瓜氨酸對照品（批號：110875-200506）購自中國藥品生物制品檢定所；γ-氨基丁酸對照品（批號：A104200）購自美國Sigma公司；栝樓桂枝顆粒（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，生產(chǎn)批號：20140701、20140702、20140703）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Ultimate AQ-C18柱（4.6× 100 mm，3 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水（5∶95），流速：0.3 mL／min，柱溫30℃。

2.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI）；源噴射電壓2 500V；源溫度：350℃；正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測。

2.3 樣品制備

2.3.1 供試品溶液制備精密稱取栝樓桂枝顆粒0.05 g，加超純水100 mL，超聲提取30 min，混勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。精密量取稱取天花粉0.5 g，加超純水50 mL，超聲提取30 min，混勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為天花粉供試品溶液。

2.3.2 陰性桂枝湯制備按照栝樓桂枝顆粒制備工藝，制備缺失天花粉的陰性樣品，同法處理，制備成陰性樣品。

2.3.3 混合對照品溶液制備分別精密稱取γ-氨基丁酸和瓜氨酸10.6 mg和9.8 mg，用超純水溶解，定容到10 mL量瓶，搖勻，配置成質(zhì)量濃度為1.060 mg／mL和0.980 0 mg／mL對照品儲(chǔ)備液。分別精密量取上述對照品儲(chǔ)備液適量，置同一10 mL量瓶中，加入超純水定容即得γ-氨基丁酸10.60μg·mL-1、瓜氨酸9.80 μg·mL-1的混合對照品儲(chǔ)備液。其他不同質(zhì)量濃度的對照品混合溶液由混合對照品儲(chǔ)備液逐級稀釋，即得。

2.4 RRLC-MS／MS定量方法學(xué)考察

2.4.1 質(zhì)譜測定方法采用MRM定量模式，2種分析物的質(zhì)譜分析條件參數(shù)見表1。

表1 2種分析物質(zhì)譜測定條件

2.4.2 專屬性考察精密量取混合對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液和天花粉供試品溶液各5 μL，按上述色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣。分別記錄色譜圖，2種成分混合對照品溶液（A圖）、陰性對照溶液（B圖）、供試品溶液（C圖）及天花粉供試品溶液（D圖），結(jié)果表明：陰性樣品在與對照品相同保留時(shí)間的位置上，無相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，說明其它組分不干擾該2種成分的測定，見圖2。

圖2 混合對照品及樣品色譜圖

2.4.3 線性關(guān)系考察取“2.3.3”項(xiàng)下方法制備的混合對照品儲(chǔ)備液，用超純水逐級稀釋配制一系列梯度濃度的對照品混合溶液，分別注入RRLC-MS／MS，按上述液質(zhì)條件測定峰面積，記錄色譜圖與峰面積；以對照品峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：

結(jié)果表明γ-氨基丁酸在0.265 0～10.60 μg／mL線性關(guān)系良好，瓜氨酸在0.019 6～9.800 μg／mL線性關(guān)系良好。

2.4.4 精密度精密吸取混合對照品溶液，按照上述液質(zhì)條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果γ-氨基丁酸與瓜氨酸的色譜峰面積RSD平均值分別為2.74%和2.67%。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平行制備6份栝樓桂枝顆粒樣品，依法測定含量，γ-氨基丁酸與瓜氨酸平均含量分別為1.497 mg／g及4.201 mg／g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為3.74%和2.15%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取“2.4.2”項(xiàng)栝樓桂枝顆粒供試品溶液5 μL，在同一條件下分別在0、1、

2、6、8、12和24 h進(jìn)樣，依法測定峰面積。結(jié)果γ-氨基丁酸與瓜氨酸峰面積的RSD分別為3.18%和2.89%，表明樣品在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取重復(fù)性批次樣品0.025 g，按近似1∶1加入γ-氨基丁酸、瓜氨酸對照品溶液，依法制備供試品，測定，計(jì)算γ-氨基丁酸、瓜氨酸的加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.5 樣品含量測定取栝樓桂枝顆粒，按2.3.1項(xiàng)方法制備樣品，按2.4.1項(xiàng)下質(zhì)譜測定方法進(jìn)行測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

3 討論

近年來，氨基酸的測定方法一般可分為氨基酸分析儀法［12］、離子色譜法［13］、高效液相色譜法［14］等，由于γ-氨基丁酸和瓜氨酸無法用氨基酸分析儀測定，并且由于氨基酸無紫外吸收，需要衍生后方能進(jìn)行檢測，劉文等［15］采用柱前衍生反相高效液相色譜法測定了天花粉中γ-氨基丁酸和瓜氨酸的含量。但是該方法操作繁瑣，衍生化試劑不穩(wěn)定，重復(fù)性較差。同時(shí)由于γ-氨基丁酸和瓜氨酸極性很強(qiáng)，普通C18色譜柱上沒有色譜保留，因此，本文采用RRLC-MS／MS法檢測栝樓桂枝顆粒中2種主要氨基酸含量，質(zhì)譜測定無需衍生化，可以通過MRM定量離子對對其準(zhǔn)確檢測。并且為了提高氨基酸的色譜保留，采用了極性C18色譜柱，兩種氨基酸在該色譜柱上，兩個(gè)成分達(dá)到基線分離，同時(shí)采用RRLC，與高效液相色譜法比較，大大縮短了分析的時(shí)間，節(jié)省流動(dòng)相，且分析靈敏度高。

綜上，本文建立的RRLC-MS／MS法測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸與瓜氨酸的含量，方法簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，重復(fù)性好，可以為栝樓桂枝顆粒質(zhì)量控制提供依據(jù)。

表3 樣品中γ-氨基丁酸和瓜氨酸加樣回收率測試結(jié)果

表4 樣品中γ-氨基丁酸和瓜氨酸含量（n=3）

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R917

A

1000-338X（2015）04-0043-03

2015-06-02

福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題（X2014132-學(xué)科）；福建省“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”項(xiàng)目（201410393008）；2015年福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目（2015Y0067）

陳阿虹（1991—），女，2014級碩士研究生，研究方向：天然藥物化學(xué)成分與活性研究。

徐偉（1975-），男，副教授。E-mail：xwfjtcm@sina.com