毛勝鳳，周 湘，范聞春，張立欽，葉建仁

（1.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安311300）

喜樹堿對番茄灰霉病菌的毒理效應(yīng)

毛勝鳳1,2，周 湘2，范聞春2，張立欽2，葉建仁1

（1.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安311300）

為探明喜樹堿對番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的毒理效應(yīng)，應(yīng)用生長速率法、電子顯微鏡觀察研究不同質(zhì)量濃度喜樹堿對番茄灰霉病菌菌絲生長、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響；番茄Lycopersicon esculentum葉片經(jīng)喜樹堿處理后接種番茄灰霉病菌，觀察藥劑對病菌侵染活性的影響。結(jié)果表明：喜樹堿為3.13 mg·L-1時(shí)就能強(qiáng)烈抑制番茄灰霉病菌菌絲生長，抑菌率達(dá)45.49%，差異顯著（P＜0.05）；可顯著影響番茄灰霉病菌對番茄活體葉片的侵染活性；喜樹堿處理可導(dǎo)致菌體細(xì)胞壁表面出現(xiàn)破損、穿孔，細(xì)胞內(nèi)含物外滲等現(xiàn)象。喜樹堿能破壞菌絲體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而抑制番茄灰霉病菌的生長，而在活體葉片可顯著影響病菌的侵染活性。圖1表3參14

植物保護(hù)學(xué)；喜樹堿；番茄灰霉病菌；毒理效應(yīng)

番茄灰霉病Botrytis cinerea是番茄Lycopersicon esculentum生產(chǎn)的限制性障礙［1-2］。生產(chǎn)上主要依靠化學(xué)防治來控制灰霉病的危害，而長期、大量、單一地使用同種藥劑已經(jīng)對環(huán)境和人類健康帶來很大的隱患，同時(shí)也引起番茄灰霉病菌產(chǎn)生抗藥性［3］，因此，必須尋找一種既有效又安全的防治措施。目前，有近一半的新藥物來自于天然產(chǎn)物［4］。喜樹堿（camptothecin）是從喜樹Camptotheca acuminata中提取出來的一種生物堿，1966年Wall等發(fā)現(xiàn)喜樹果實(shí)提取物對小鼠肺癌Ad-755有一定的抑制作用，國內(nèi)外掀起了對喜樹堿的研究熱潮，并對喜樹堿的藥理活性、臨床應(yīng)用及光照對喜樹堿合成影響等方面進(jìn)行了大量研究［5］，喜樹堿系列衍生物抗癌藥物是附加值極高的高技術(shù)產(chǎn)品［6］。已有報(bào)道：作為植物源農(nóng)藥的喜樹葉乙醇提取物和水提物對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，大腸埃希菌Escherichia coli，枯草桿菌 Bacillus subtilis，八疊球菌 Sarcina ventriculi有明顯的抑制作用，喜樹葉乙醇提取物對黑曲霉 Aspergillus niger，木霉Trichoderma virid和青霉Penicillium chrysogenum有的抗菌活性，但是水提物對霉菌沒有抑制作用［7］。發(fā)現(xiàn)喜樹乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum，小麥赤霉病菌Fusarium graminearum，番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum等15種植物病原菌有抗菌活性［8］。張立欽等［9］以喜樹堿為原藥，進(jìn)行農(nóng)用殺菌劑的開發(fā)與研究。室內(nèi)盆栽的活體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：喜樹堿對水稻紋枯病Rhizoctonia solani，黃瓜白粉病Sphaerotheca fuliginea，黃瓜霜霉病Pseudoperonospora cubensis均有較高的殺菌活性，半數(shù)致死質(zhì)量濃度分別為41.964， 40.495， 27.489 mg·L-1。同時(shí)，黃瓜霜霉病的田間藥劑試驗(yàn)結(jié)果表明：喜樹堿對霜霉病菌有殺菌活性，其半數(shù)致死質(zhì)量濃度為11.221 mg·L-1，因此，喜樹堿可能成為有效的生物源殺菌劑。然而截至目前，對于喜樹堿是如何抑制植物病原菌的卻知之甚少。本試驗(yàn)研究了喜樹堿對番茄灰霉病菌的形態(tài)毒理，對菌體細(xì)胞壁和菌體生長發(fā)育的影響，以期為植物源農(nóng)藥的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea由浙江農(nóng)林大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。藥劑和主要儀器：喜樹堿（camptothecin，簡寫CPT）（純度≥95%）從湖北威得利化學(xué)科技有限公司購買。MLS-3750全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋（日本SANYO），MfⅡ全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀（中國杭州SHINESO）， HCP-2型臨界干燥儀 （日本），IB-5型離子濺射儀（日本），XL30-ESEM型環(huán)境掃描電鏡（荷蘭飛利浦公司），Reichert超薄切片機(jī)（德國）。

供試植株：供試番茄品種為歐粉308 F1，采用基質(zhì)育苗，待幼苗長至2～4片真葉時(shí)，選擇長勢一致的健康植株移栽到直徑12.5 cm的塑料盆缽中，于溫室中培養(yǎng)，待用。

溶液配制：準(zhǔn)確稱取喜樹堿粉末0.2 g，加入到200 mL的錐形瓶中，然后往錐形瓶中加入50 mL的N,N-二甲基亞砜（DMSO），在40℃水浴鍋中加熱溶解，直到溶液完全澄清，即為4 000 mg·L-1的喜樹堿溶液（母液）。放在4℃冰箱里保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 喜樹堿對病菌的抑菌活性 菌種培養(yǎng)：供試番茄灰霉病菌接于裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基直徑為 9 cm的培皿中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h后，備用。在超凈工作臺(tái)上，將喜樹堿母液加入到滅菌后冷卻至50～60℃的PDA培養(yǎng)基中，使喜樹堿溶液與PDA培養(yǎng)基完全混勻，制得喜樹堿的質(zhì)量濃度梯度為200.00，100.00，50.00，25.00，12.50，6.25，3.13和 0 mg·L-1的含喜樹堿的培養(yǎng)基，然后將制得的含喜樹堿的培養(yǎng)基倒入滅過菌的培養(yǎng)皿中，15 mL·皿-1。待培養(yǎng)基凝固后，用6 mm的打孔器在長有番茄灰霉病菌菌落的培養(yǎng)基上打孔，用無菌鑷子分別加到凝固的含藥平板培養(yǎng)基表面的正中。接種時(shí)按7個(gè)質(zhì)量濃度梯度和1個(gè)空白對照水來接種，重復(fù)接種3個(gè)·質(zhì)量濃度-1。在25℃下恒溫培養(yǎng)，每天定時(shí)測量菌落直徑。按公式計(jì)算菌落抑菌率 （計(jì)算抑菌率時(shí)以水處理為對照）：菌落直徑（mm）=菌落平均直徑（mm）-5 mm（菌餅直徑）。相對抑制率={［對照菌落直徑（mm）-處理菌落直徑（mm）］/對照菌落直徑（mm）}×100%。所得數(shù)據(jù)用DPS軟件中的Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)（P=0.05），并計(jì)算半最大效應(yīng)濃度（CEC50）的軟件得到線形回歸方程和CEC50的濃度。

1.2.2 喜樹堿對病菌的形態(tài)毒理 將喜樹堿配成所需的半最大效應(yīng)濃度（CEC50），將剪好的適量的濾紙片分別放入稀釋好的喜樹堿溶液和無菌水中，浸泡0.5 h。將滅過菌的融化的培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，15 mL·皿-1，共倒6個(gè)皿。待其凝固后，在其中3個(gè)皿中央加入喜樹堿浸泡的濾紙片，然后將菌餅（直徑5 mm）接種于濾紙片里面中央位置。另3個(gè)皿中加入無菌水浸泡的濾紙片，在中央接入上述的菌餅。于28℃下恒溫培養(yǎng)48 h。取樣及前處理［10］：取培養(yǎng)24，48，72 h的經(jīng)過藥液處理和未處理的對照番茄灰霉病菌，分別于菌絲邊緣處（菌絲稀疏處）切約1.0 cm×1.0 cm大小的正方形小塊（各2塊）樣品。將樣品固定在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜；倒掉固定液，用0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，15 min·次-1；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鋨酸溶液中固定1～2 h；倒掉固定液，用0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次， 15 min·次-1；用梯度體積分?jǐn)?shù)不同的乙醇（包括50%，70%，80%，90%，95%）溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，處理15 min·體積分?jǐn)?shù)-1，用體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇處理2次， 20 min·次-1；用乙醇與醋酸異戊脂的混合液［V（乙醇）∶V（醋）=1∶1］處理樣品30 min，再用純醋酸異戊脂處理樣品1～2 h。將處理好的樣品進(jìn)行干燥，將干燥好的樣品鍍膜，掃描電鏡觀察，得到圖像后進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.3 活體條件下喜樹堿對番茄灰霉病菌的活性［11］保護(hù)作用的測定：用剪刀將生長旺盛的8～10葉期番茄植株相同部位葉片帶葉柄快速剪下，將葉片在不同質(zhì)量濃度的喜樹堿藥液中浸漬3～5 s后自然晾干，葉柄用脫脂棉包裹，置于9 cm培養(yǎng)皿中，對照以不含藥劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的T-80無菌水處理。用直徑6 mm的滅菌打孔器從25℃下培養(yǎng)4 d的番茄灰霉病菌菌落邊緣打取菌餅，接種于葉片中脈處，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后觀察發(fā)病情況，十字交叉法測量葉片上的病斑直徑。重復(fù)3次·質(zhì)量濃度-1，葉片10片·處理-1。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)用DPS軟件中的Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)（P= 0.05）。葉片法中，十字交叉測量葉片上的病斑直徑，根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，計(jì)算防治效果。P（%）=［（D0-D1）/ D0］×100%。其中：P為防治效果；D0為空白對照病斑直徑；D1為藥劑處理病斑直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 喜樹堿對番茄灰霉菌病菌的毒力

離體測定結(jié)果表明：喜樹堿對菌絲生長有抑制作用，其質(zhì)量濃度反應(yīng)曲線相關(guān)性較好。喜樹堿帶毒培養(yǎng)基培養(yǎng)番茄灰霉病菌，培養(yǎng)7 d后，測量各質(zhì)量濃度的菌落直徑并計(jì)算平均值和各質(zhì)量濃度的抑制率（表1）。發(fā)現(xiàn)較低質(zhì)量濃度的喜樹堿就對番茄灰霉病菌的生長有抑制作用，質(zhì)量濃度為6.25 mg·L-1時(shí)，抑制率達(dá)62%。喜樹堿對番茄灰霉抑制的半最大效應(yīng)濃度（CEC50）是3.503 1 mg·L-1。這比百菌清對番茄灰霉抑制CEC50（9.583 4 mg·L-1）小了近 3倍，跟福美雙（CEC50為 4.480 3 mg·L-1）和退菌特（CEC50為 3.208 1 mg·L-1）［12］差不多。根據(jù)上表的結(jié)果，用計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的軟件得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2）。

表1 不同質(zhì)量濃度的喜樹堿對番茄灰霉菌的抑制效果Table 1 Restraining effect of different concentration camptothecin on Botrytis cinerea

表2 喜樹堿對番茄灰霉菌的毒力回歸方程Table 2 Toxicity regression equation of camptothecin for Botrytis cinerea

2.2 喜樹堿對番茄灰霉病菌的形態(tài)毒理影響

喜樹堿處理的番茄灰霉病菌其菌落邊緣的菌絲生長雜亂，生長速度減緩，如圖1所示。對照組的未經(jīng)喜樹堿處理的番茄灰霉病菌生長良好，菌落邊緣的菌絲纖細(xì)直長，粗細(xì)均勻一致，線條流暢；經(jīng)喜樹堿處理 24 h后的番茄灰霉病菌，菌落邊緣的菌絲生長沒有對照組那么均勻，菌絲生長速度變慢；處理48 h后，菌落邊緣的菌絲部分出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象，菌絲不再有明顯的生長；處理 72 h后，菌落邊緣的菌絲塌陷較多，菌落不再向外緣擴(kuò)展。

喜樹堿處理的番茄灰霉病菌菌絲出現(xiàn)了塌陷現(xiàn)象（圖1下右）。未經(jīng)喜樹堿處理的番茄灰霉病菌，菌絲光滑而飽滿，伸展良好（圖1上左）；經(jīng)喜樹堿處理 24 h后的番茄灰霉病菌，菌絲表面粗糙（圖1上右）；處理 48 h后，菌絲表面粗糙，并且部分出現(xiàn)了塌陷現(xiàn)象（圖1下左）；處理 72 h后，菌絲基本上全部出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象（圖1下右）。

圖1 喜樹堿處理對番茄灰霉病菌菌絲形態(tài)的影響Figure 1 Effect of camptothecin treatment on mycelial shape of Botrytis cinerea

2.3 活體條件下喜樹堿對番茄灰霉病菌的影響

從健康番茄植株相同部位上取下生長一致的葉片測定喜樹堿的活性（表3）。經(jīng)喜樹堿處理后再接菌的番茄葉片上的病斑大小與對照存在顯著差異，且不同喜樹堿質(zhì)量濃度處理間也存在顯著差異。質(zhì)量濃度為3.13 mg·L-1和6.25 mg·L-1時(shí)沒有什么防治效果，葉片上的病斑隨著質(zhì)量濃度的增大有所減小，防治效果則隨著質(zhì)量濃度的增大有所提高。

3 結(jié)論與討論

表3 活體條件下喜樹堿對番茄灰霉病菌的活性Table 3 In vivo effects of camptothecin on Botrytis cinerea

本試驗(yàn)從離體和活體試驗(yàn)的變化上來研究喜樹堿對番茄灰霉菌的毒理效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)喜樹堿對番茄灰霉病菌的菌絲生長有抑制作用，質(zhì)量濃度為3.13 mg·L-1時(shí)，抑制率有45.49%；喜樹堿對番茄灰霉病菌菌絲形態(tài)有明顯的影響，處理后的菌絲塌陷現(xiàn)象嚴(yán)重、生長點(diǎn)畸形和縊縮、內(nèi)含物外滲現(xiàn)象明顯。初步推測喜樹堿處理番茄灰霉病菌后，引起細(xì)胞膜損傷及結(jié)構(gòu)改變，接著出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)含物外滲，最后導(dǎo)致菌絲體塌陷，直到停止生長。活體試驗(yàn)得出了相同的結(jié)論，即當(dāng)葉片使用喜樹堿處理，可對該病菌的侵染起到一定的控制作用。而在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)離體的毒力效果要比活體試驗(yàn)時(shí)強(qiáng)，原因可能是離體培養(yǎng)時(shí)所有的培養(yǎng)條件比較一致，不存在寄主的影響，而在活體試驗(yàn)中增加了番茄植株為寄主，在噴施藥劑后對病菌的影響就沒有單一培養(yǎng)基上效果那么顯著。若要作為農(nóng)藥開發(fā)，還要進(jìn)行環(huán)境毒理研究和大田試驗(yàn)等進(jìn)一步的探索。

在醫(yī)學(xué)上研究得到：喜樹堿的作用是使拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、喜樹堿和DNA形成三元復(fù)合體，而使DNA在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［13］。喜樹堿處理細(xì)胞導(dǎo)致短暫的細(xì)胞色素cyt c表達(dá)增加，活化呼吸鏈，引起細(xì)胞色素cyt c釋放，激活胞質(zhì)和線粒體中的caspase，導(dǎo)致線粒體發(fā)生內(nèi)源性降解和膜電位的喪失，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14］。我們研究發(fā)現(xiàn)：喜樹堿處理后的菌絲內(nèi)含物外滲隨即出現(xiàn)菌絲塌陷現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞壞死，但是喜樹堿對于番茄灰霉病菌的作用位點(diǎn)是否就是在線粒體，是否會(huì)引起細(xì)胞色素cyt c表達(dá)量的變化，喜樹堿的抑菌機(jī)理是否通過相同的方式作用還需要深入研究。

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Toxicological effects of camptothecin to Botrytis cinerea

MAO Shengfeng1,2,ZHOU Xiang2,FAN Wenchun2,ZHANG Liqin2,YE Jianren1
（1.Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China,College of Forestry,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,Jiangsu,China;2.School of Forestry and Biotechnology,Zhejiang A& F University, Lin’an 311300,Zhejiang,China）

In order to ascertain the toxicology effects of camptothecin to Botrytis cinerea,growth rates were determined by the application of different concentrations of camptothecin inhibition of mycelial growth and cell well structure of B.cinerea.The results showed that camptothecin concentration 3.13 mg·L-1can strongly inhibit the mycelial growth,inhibition rate 45.49%antibacterial rate of significant differences.In the scanning electron microscope,camptothecin treated by B.cinerea,mycelial cells rupture,perforation,shriveled,growing point of collapse,cytoplasmic extravasation.In vivo effects of camptothecin on B.Cinerea showed that camptothecin against B.cinerea has a significant protective effect.［Ch,1 fig.3 tab.14 ref.］

plant protection;camptothecin;Botrytis cinerea;toxicological effects

S482.2

A

2095-0756（2015）04-0585-05

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.04.014

2015-01-04；

2015-03-04

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY14C140005）；浙江農(nóng)林大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201302021）

毛勝鳳，高級實(shí)驗(yàn)師，從事森林保護(hù)與生物防治研究。E-mail：maosf@126.com。通信作者：葉建仁，教授，博士，從事森林保護(hù)與森林病理學(xué)研究。E-mail：jrye@njfu.com.cn