王　亮，倪為波，楊紅申

(1.河北省胸科醫(yī)院呼吸科，河北 石家莊 050041；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸科，河北 石家莊 050000)

鹽酸多西環(huán)素對哮喘大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1平衡的影響

王亮1，倪為波1，楊紅申2*

(1.河北省胸科醫(yī)院呼吸科，河北 石家莊 050041；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸科，河北 石家莊 050000)

[摘要]目的通過觀察多西環(huán)素對哮喘大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)平衡的影響，探討哮喘臨床治療的新途徑。方法SD健康雄性大鼠33只隨機(jī)分為3組，即正常對照組、哮喘模型組、多西環(huán)素干預(yù)組，每組11只。通過口腔灌服多西環(huán)素的方式對哮喘大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1的表達(dá)。結(jié)果哮喘模型組細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、氣道管壁及平滑肌厚度、MMP-9及TIMP-1表達(dá)均明顯高于正常對照組，多西環(huán)素干預(yù)組較正常對照組亦明顯升高(P<0.01)。哮喘模型組MMP-9/TIMP-1低于正常對照組和多西環(huán)素干預(yù)組，多西環(huán)素干預(yù)組亦低于正常對照組(P<0.01)。結(jié)論多西環(huán)素可通過對MMP-9/TIMP-1平衡調(diào)節(jié)減緩哮喘的氣道炎癥和氣道重塑。

[關(guān)鍵詞]哮喘；基質(zhì)金屬蛋白酶9；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.05.003

支氣管哮喘(bronchial asthma)是由多種炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)參與的氣道慢性非特異性疾病。眾多研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)的平衡對氣道重塑的影響最為明顯[1-2]。多西環(huán)素除用于控制感染外，還具有免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞因子合成、抑制MMPs活性的作用[3]。然而，多西環(huán)素對MMP-9與TIMP-1平衡的影響尚不明確，對哮喘氣道炎癥、氣道重塑是否存在干預(yù)作用及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究通過多西環(huán)素干預(yù)哮喘大鼠模型，以MMP-9、TIMP-1作為主要觀察指標(biāo)，研究多西環(huán)素對MMP-9、TIMP-1平衡及氣道重塑的影響，探討其可能的作用機(jī)制，旨在為哮喘治療提供新思路。

1材料與方法

1.1動物來源SD健康雄性大鼠33只，6周齡，體質(zhì)量50~100 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，標(biāo)準(zhǔn)日糧和無菌飲用水，自由飲食。將所有大鼠按體質(zhì)量從小到大排序，依照隨機(jī)數(shù)字表給出的數(shù)據(jù)，從小到大排列，1~11為正常對照組，12~22為哮喘模型組，23~33為多西環(huán)素干預(yù)組，每組11只。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型的建立[4-5]哮喘模型組和多西環(huán)素干預(yù)組在實(shí)驗(yàn)的第1、8天向大鼠腹腔注射卵蛋白100 mg和氫氧化鋁100 mg(混于生理鹽水2 mL中)進(jìn)行致敏。第15天起將待激發(fā)大鼠放于自制的、非完全密閉霧化吸入箱中，霧化吸入卵清蛋白溶液。溶液濃度從1%開始依次遞增，之后為1.5%、2%、2.5%、3%，每4次激發(fā)后增加1次卵清蛋白濃度，每次30 min，隔日1次，共激發(fā)20次。待大鼠出現(xiàn)嗆咳、煩躁、呼吸急促、活動量下降等癥狀表示激發(fā)成功。正常對照組以等量生理鹽水代替卵清蛋白溶液。多西環(huán)素干預(yù)組在每次激發(fā)前30 min口腔灌服多西環(huán)素溶液，劑量為30 mg/kg[6]。大鼠末次激發(fā)24 h后，用1%戊巴比妥鈉麻醉后處死并取材。

1.2.2取材將大鼠麻醉摘取右肺下葉組織，以4%甲醛溶液固定后保存，行病理切片及免疫組織化學(xué)；左側(cè)肺組織行支氣管肺泡灌洗，離心(4 ℃，1 000 r/min)10 min，進(jìn)行細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)。

1.3觀察指標(biāo)觀察支氣管肺泡灌洗細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類、肺組織病理切片，免疫組織化學(xué)法檢測肺組織MMP-9及TIMP-1的表達(dá)。

2結(jié)果

2.1肺組織病理切片HE染色結(jié)果正常對照組的大鼠肺組織病理切片可見支氣管黏膜上皮、黏膜肌層、肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管管腔規(guī)則,腔內(nèi)未見炎性滲出物，氣道周圍偶見炎性細(xì)胞(圖1A)。哮喘模型組大鼠肺組織病理切片可見支氣管黏膜增厚、氣道平滑肌明顯增厚；氣道周圍、肺泡間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤(圖1B)。多西環(huán)素干預(yù)組的支氣管壁增厚程度、血管增生及炎性細(xì)胞浸潤等均較哮喘模型組減輕(圖1C)。

2.2支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)中細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞分類的變化哮喘模型組BALF中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞均高于正常對照組(P<0.01)；多西環(huán)素干預(yù)組以上指標(biāo)均較哮喘模型組明顯下降(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.05)。見表1。

2.3氣道管壁厚度和平滑肌厚度比較哮喘模型組管壁厚度和平滑肌厚度均高于正常對正常照組(P<0.01)；多西環(huán)素干預(yù)組以上指標(biāo)均較哮喘模型組明顯下降(P<0.01)，但仍高于正常對照組(P<0.01)。見表2。

2.4MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比較哮喘模型組氣道中MMP-9、TIMP-1均高于對照組(P<0.01)；多西環(huán)素干預(yù)組MMP-9、TIMP-1均較哮喘組明顯下降(P<0.01)，但仍高于正常對照組(P<0.01)。哮喘模型組和多西環(huán)素干預(yù)組MMP-9/TIMP-1均低于正常對照組(P<0.01)，哮喘模型組MMP-9/TIMP-1低于多西環(huán)素干預(yù)組(P<0.01)。見表3，圖2，3。

表1　3組BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞分類比較Table 1　The number and class of cells in BALF among three groups

表1　3組BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞分類比較Table 1　The number and class of cells in BALF among three groups

組別細(xì)胞總數(shù)中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞正常對照組 9.42±3.670.23±0.141.18±0.381.24±0.72哮喘模型組 35.53±7.06*1.12±0.30*2.63±0.33*4.84±0.65*多西環(huán)素干預(yù)組14.66±5.81*#0.59±0.19*#2.05±0.58*#2.14±0.58*#F64.84045.00729.88190.598P0.0000.0000.0000.000

*P<0.01與正常對照組比較#P<0.01與哮喘模型組比較(q檢驗(yàn))

表2　3組氣道管壁厚度和平滑肌厚度比較Table 2　The airway wall thickness and smooth muscle thickness among three groups　

*P<0.01與正常對照組比較#P<0.01與哮喘模型組比較(q檢驗(yàn))

表3　3組氣道中MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比較Table 3　MMP-9,TIMP-1 and MMP-9/TIMP-1 expression in lung among three groups　

*P<0.01與正常對照組比較#P<0.01與哮喘模型組比較(q檢驗(yàn))

3討論

MMPs是由20多種高度保守的鋅、鈣離子依賴蛋白內(nèi)切酶組成，能分解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白成分。依據(jù)底物的不同，MMPs可分為明膠酶類、間質(zhì)膠原酶類、基質(zhì)溶解素、膜型MMPs及其他MMPs[7]。MMP-9屬于明膠酶類，與哮喘的關(guān)系最為密切。MMP-9來源豐富，多種細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等均可產(chǎn)生MMP-9，但其產(chǎn)量較少，一般情況下難以檢測[8]。在氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展的過程中，MMP-9起到了重要的調(diào)節(jié)作用，它能促進(jìn)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的滲出，加重炎癥反應(yīng)。研究表明，與野生型小鼠相比較，MMP-9基因敲除的小鼠在卵蛋白致敏后其BALF以及支氣管周圍淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的表達(dá)明顯減少，而野生小鼠在激發(fā)后表現(xiàn)出明顯的氣道高反應(yīng)性，MMP-9相關(guān)的明膠含量增多[9]。從而證實(shí)MMP-9在氣道炎癥發(fā)展中起到了關(guān)鍵性作用。

鹽酸多西環(huán)素為一種半合成四環(huán)素類抗生素，研究發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素對MMPs具有高效的抑制作用，通過封閉MMPs中的金屬離子導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變而使MMPs失去活性[9]。多西環(huán)素通過抑制MMPmRNA轉(zhuǎn)錄[10]或使酶原在細(xì)胞外激活過程中降解[11]的方式，降低了MMPs(MMP-2、MMP-9)活性可能是其作用機(jī)制之一。Gueders等[12]首次證實(shí)吸入多西環(huán)素可抑制過敏原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性，BALF及支氣管周圍的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，預(yù)防過敏原誘導(dǎo)的支氣管形態(tài)改變，可抑制腺體增生、氣道壁和平滑肌層增厚和支氣管旁膠原沉積。多西環(huán)素降低了小鼠肺組織的MMP-9和MMP-2的活性及MMP-9/ MMP-9蛋白的比值，推測多西環(huán)素可能通過抑制Th2細(xì)胞及MMP-9活性發(fā)揮其干預(yù)哮喘氣道炎癥及氣道重塑的作用。Cataldo等[13]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者誘導(dǎo)痰中MMP-9水平升高，但TIMP-1水平無明顯變化，引起MMP-9/TIMP-1失衡，從而導(dǎo)致MMP-9蛋白水解作用增強(qiáng)。目前對哮喘中MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的關(guān)系問題尚未達(dá)成統(tǒng)一認(rèn)識。部分研究表明一氧化氮在哮喘的氣道重塑過程中起到了重要作用，而多西環(huán)素可減少誘生型一氧化氮合酶的表達(dá)，這可能是多西環(huán)素緩解氣道重塑的潛在機(jī)制之一[14]。但多西環(huán)素通過對MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的調(diào)節(jié)，減輕氣道炎癥和氣道重塑是值得肯定的。

目前，關(guān)于多西環(huán)素通過調(diào)節(jié)MMP-9、TIMP-1的表達(dá)，從而干預(yù)哮喘氣道重塑的文獻(xiàn)較少，本研究以此為切入點(diǎn)，希望能解釋其作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示哮喘模型組MMP-9、TIMP-1的表達(dá)較正常對照組明顯升高；多西環(huán)素干預(yù)后，MMP-9、TIMP-1均呈下降趨勢，對TIMP-1的調(diào)節(jié)更為明顯，使MMP-9/TIMP-1較哮喘模型組有所升高。說明在哮喘過程中，TIMP-1過度表達(dá)，細(xì)胞外基質(zhì)形成增加，出現(xiàn)管壁增厚、平滑肌增加等表現(xiàn)，MMP-9的表達(dá)也隨之升高，從而導(dǎo)致氣道的修復(fù)過度。多西環(huán)素干預(yù)后可下調(diào)TIMP-1的表達(dá)，減緩氣道重塑。本研究中 MMP-9也呈下降趨勢，這一變化可能是因?yàn)門IMP-1減弱而隨之出現(xiàn)的相關(guān)變化。總之，多西環(huán)素可通過對MMP-9/TIMP-1平衡調(diào)節(jié)減緩哮喘的氣道炎癥和氣道重塑。

綜上所述，多西環(huán)素可通過降低TIMP-1的表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的平衡，減少炎癥細(xì)胞的浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)沉積，減緩哮喘的氣道重塑。但明確各個(gè)細(xì)胞因子之間的相互影響及其具體機(jī)制，仍需更加深入的研究。(本文圖見封二)

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(本文編輯：許卓文)

[收稿日期]2014-11-28；[修回日期]2015-03-25

[基金項(xiàng)目]河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20120248)

[作者簡介]王亮(1979-)，男，河北石家莊人，河北省胸科醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事呼吸系統(tǒng)疾病診治研究。 *通訊作者。E-mail:wlyc1111@sohu.com

[中圖分類號]R562.25

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)05-0505-04

Effects of doxycycline on matrix metalloprotein 9/tissue inhibitor of metalloproteinases 1 balance in asthmatic rats

WANG Liang1，NI Wei-bo1,YANG Hong-shen2*

(1.Department of Respiratory Medicine,the Chest Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050041,China;

2.Department of Respiratory Medicine,the Second Hospital of Hebei Medical University,

Shijiazhuang 050000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of doxycycline on matrix metalloprotein 9(MMP-9)/ tissue inhibitor of metalloproteinases 1(TIMP-1)expression in asthmatic rats model for a novel way in clinical prevention of asthma.MethodsThirty-three SD male rats were randomly divided into three groups(11 rats a group): normal control group,asthma group and doxycycline intervention group.Doxycycline intervention group was gavaged with doxycycline before OVA challenge.MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue were observed by immunohistochemistry.ResultsThe expression levels of eosinophils and neutrophils in bronchial alveolar lavage fluid(BALF) of asthma group were significantly higher than those of control group and doxycycline intervention group ; the eosinophils of doxycycline intervention group was higher than that of control group.The airway wall and the smooth muscle in asthma group were significantly thicker than those of doxycycline intervention group and control group.The airway wall and the smooth muscle of doxycycline group were thicker than those of control group.The expression of MMP-9 and TIMP-1 in asthma group were significantly higher than those of control group and doxycycline group,and doxycycline group higher than control group(P<0.01).ConclusionDoxycycline can ameliorate airway inflammation and airway remodeling by decreasing the ratio of MMP-9/TIMP-1.

[Key words]asthma; matrix metalloproteinase 9；tissue inhibitor of metalloproteinases 1