賀 偉，劉永樂*，王發(fā)祥

響應(yīng)面法優(yōu)化蓮子磨皮粉中蛋白質(zhì)的提取工藝

賀 偉，劉永樂*，王發(fā)祥

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410 114）

磨皮粉是紅蓮子加工時機械磨皮的副產(chǎn)物，不僅產(chǎn)量很大，而且營養(yǎng)成分豐富，若不綜合利用會導(dǎo)致嚴重的資源浪費。通過Plackett-Burman試驗→最陡爬坡試驗→響應(yīng)面試驗的模式設(shè)計方法，考察溫度、時間等因素對磨皮粉蛋白質(zhì)提取率的影響，獲得磨皮粉蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)條件是Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03 mol/L、液固比17.5∶1（mL/g）、pH 10.5、提取溫度20 ℃、提取時間1 h、攪拌間隔時間10 min、超聲時間7.5 min，此時蛋白質(zhì)提取率達93.38%。

蓮子；蓮子磨皮粉；蛋白質(zhì)；響應(yīng)面法

蓮子是我國特有的種質(zhì)資源，屬睡蓮科多年水生草本植物蓮的成熟種子。我國蓮子種植面積150多萬畝，主要集中在湖南、湖北、江蘇、浙江、江西、福建等地區(qū)省市[1-5]。蓮子自古以來就是我國及東亞、東南亞人民所喜愛的珍貴營品，其味道清香，營養(yǎng)豐富，滋補療效顯著，而且蛋白質(zhì)、維生素、糖及鈣、磷等多種人體必需的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)含量也較高[6-12]。因此，蓮子相關(guān)產(chǎn)品深受消費者喜愛，市場前景廣闊，蓮子的加工率和加工水平也在逐年提高。

在干蓮子加工過程中，為避免相關(guān)產(chǎn)品的外觀和口感受到影響，常常需要經(jīng)過機械處理去掉蓮子表面棕紅色的種皮，機械磨皮過程會產(chǎn)生約占蓮子總質(zhì)量1/5的蓮子磨皮粉，其不僅產(chǎn)量巨大，而且營養(yǎng)豐富，其中蛋白質(zhì)含量為18%～19%，淀粉含量更是高達40.00%。然而，在實際生產(chǎn)中，磨皮粉大多成了低值廢棄物，主要用于生產(chǎn)飼料甚至直接扔掉，造成了嚴重的資源浪費和環(huán)境污染[13-14]。因此研究蓮子磨皮粉的高值化利用技術(shù)，對提高蓮子的綜合價值和保護環(huán)境都有著重要的實際意義。

近年來，蓮子磨皮粉的綜合利用開始受到關(guān)注，研究人員也開展了一些相關(guān)的研究，如陳軒等[15]對蓮子皮的化學(xué)成分進行了初步分析，徐虹等[16-17]采用微波鹽提法優(yōu)化了蓮子皮蛋白質(zhì)提取工藝，但研究仍不夠深入。本研究創(chuàng)新采用Na2CO3-NaHCO3緩沖液[18]代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鹽或堿提取液，通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、響應(yīng)面試驗優(yōu)化磨皮粉蛋白質(zhì)提取條件，為將蓮子磨皮粉用于生產(chǎn)蓮子蛋白粉或其他含蓮蛋白食品及實現(xiàn)蓮子磨皮粉的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子磨皮粉由湖南粒粒珍湘蓮有限公司提供。

無水Na2CO3、NaHCO3、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、甲基紅、溴甲酚綠等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ATN-300全自動凱氏定氮儀 上海洪紀儀器設(shè)備有限公司；BL-620S島津電子天平 日本島津公司；LG10-2.4A型高速離心機 北京京立離心機有限公司；高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓮子磨皮粉的制備

蓮子磨皮粉經(jīng)高速粉碎機粉碎后過80 目篩，分裝，置于干燥器中備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量及提取率的測定

參考GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》[19]，測定磨皮粉中蛋白質(zhì)含量。準確稱取一定量的磨皮粉，在一定條件下提取蛋白質(zhì)后離心，將上液定容至100 mL，再取5 mL進行消化，以凱氏定氮法測定提取液中的蛋白質(zhì)含量。按下式計算蛋白質(zhì)提取率。

1.3.3 提取液的篩選

分別以蒸餾水、0.5 mol/L NaCl溶液、0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 9.15）、0.2 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 7.0）對蓮子磨皮粉的蛋白質(zhì)進行提取，以蛋白質(zhì)提取率為指標，選擇合適的提取液。

1.3.4 Plackett-Burman篩選顯著因子

根據(jù)經(jīng)驗及前期實驗摸索，選取Na2CO3-NaHCO3緩沖液作為蛋白質(zhì)提取劑，對緩沖液濃度、pH值、液固比、提取溫度、提取時間、超聲時間、攪拌間隔時間這7 個影響蛋白質(zhì)提取效果的因素進行考察，以蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，根據(jù)試驗結(jié)果對因素進行顯著性評價（P＜0.05），篩選出顯著性因子。試驗因素及水平見表1。

表 1 Plaekett-Burman試驗因素及水平Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.5 最陡爬坡試驗確定中心點

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，選取Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度、液固比、pH值3 個顯著因素進行最陡爬坡試驗，其他各因素則根據(jù)效應(yīng)系數(shù)正負選擇相應(yīng)的水平，從而快速地接近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.6 Box-Behnken試驗設(shè)計

以最陡爬坡試驗確定的提取率響應(yīng)值最大的條件為中心點，以Design-Expert 8.0.5b軟件進行Box-Behnken試驗設(shè)計，試驗因素與水平見表2。

表 2 Box-Behnken試驗因素水平Table 2 Factors and levels used in Box-Benhnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取液選擇結(jié)果

表 3 不同提取液提取效果Table 3 Effect of different extract solvents on the extraction efficiency of protein

采用不同提取液對蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)進行提取，結(jié)果如表3所示。根據(jù)提取率的結(jié)果可知，0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 9.15）對磨皮粉蛋白質(zhì)的提取率最高，以其為最佳提取液，進行下一步實驗。

2.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果

表 4 Plaekett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Plackett-Burman design and experimental resultsTable 4 Plackett-Burman design and experimental results

Plackett-Burman法是一種近飽和的二水平試驗設(shè)計方法。它能用最少試驗次數(shù)估計出因素的主效應(yīng)，以便快速有效地從眾多考察因素中篩選出最為重要的幾個因素供進行下一步研究[20-23]。采用N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計，結(jié)果如表4所示。

表 5 Plackett-Burman試驗結(jié)果的估計效應(yīng)和系數(shù)Table 5 Analysis of variance (AVONA) of Plackett-Burman experimental results

圖 1 標準化效應(yīng)的Pareto圖（響應(yīng)為提取率，α=0.01，臨界值2.920）Fig.1 Pareto chart of the standardized effects (response for the extraction yield, α = 0.01)

用Minitab 16軟件對表4中的Plackett-Burman試驗結(jié)果進行分析，得到各因素的方差分析結(jié)果（表5）以及標準化效應(yīng)的Pareto圖（圖1）。經(jīng)分析可知Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度、提取溫度、攪拌間隔時間對磨皮粉蛋白質(zhì)提取率顯示出負效應(yīng)，而pH值、液固比、提取時間、超聲時間顯示為正效應(yīng)。標準化效應(yīng)的Pareto圖則顯示在90%的置信水平內(nèi)，液固比、Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度以及pH值的效應(yīng)最大，對提取率響應(yīng)值影響顯著。

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

最陡爬坡試驗是一種通過連續(xù)增加或減少顯著因素的試驗值以使響應(yīng)值快速逼近最佳值區(qū)域的程序，其爬坡的方向由各因素效應(yīng)系數(shù)的正負決定，變化步長則根據(jù)經(jīng)驗及相關(guān)效應(yīng)值的大小來確定。最陡爬坡試驗確定的顯著因素的變化幅度分別為Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.01 mol/L、pH 0.2、液固比2∶1，提取時間和攪拌間隔時間取Plackett-Burman試驗時的高水平，其余因素取值Plackett-Burman試驗時的低水平。分析最陡爬坡試驗結(jié)果（表6）可知：0＋3Δ號試驗組的提取率響應(yīng)值達93.30%，為最大值，之后響應(yīng)值開始下降。選取此試驗條件作為Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計的中心點。

表 6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Steepest ascent design and experimental results

2.4 Box-Behnken試驗結(jié)果

表 7 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Box-Behnken design and experimental resultsTable 7 Box-Behnken design and experimental results

表 8 Box-Behnken試驗結(jié)果方差分析Table 8 ANOVA of Box-Behnken experimental results

響應(yīng)面試驗的設(shè)計及結(jié)果分析見表7。利用Design-Expert 8.0.5b軟件對試驗結(jié)果進行二次多元回歸擬合[24-26]，編碼回歸方程Y=92.81＋0.73A-0.82B＋0.72C-0.062AB＋0.38AC-0.59BC-2.84A2-2.90B2-0.12C2，而實際因素的回歸方程為：蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率=-360.067 42＋16.437 50A＋33.196 25B＋29.292 19C-1.562 50AB＋46.875 00AC-0.737 50BC-7090.625 00A2-0.725 31B2-0.773 44C2，為了驗證模型的有效性，進行了方差分析（表8）。如表8所示，A、B、A2、B2為顯著性影響因素，其他變量的影響均不顯著（P＞0.05）。該回歸模型的P值為0.005 4（小于0.01），即模型顯著擬合程度好。同時失擬項P值為0.313 4（大于0.05），即失擬項不顯著，說明該響應(yīng)面能夠較真實地反映試驗結(jié)果，有實際應(yīng)用意義，可用此模型對蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的提取效果進行分析預(yù)測。

圖 2 Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度和液固比對提取率的影響Fig.2 Effect of Na2CO3-NaHCO3concentration and solvent-to-solid ratio on the extraction efficiency of protein

圖 3 Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度和pH值對提取率的影響Fig.3 Effect of Na2CO3-NaHCO3concentration and pH on the extraction efficiency of protein

圖 4 液固比和pH值對提取率的影響Fig.4 Effect of solvent-to-solid ratio and pH on the extraction efficiency of protein

從圖2 Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度與液固比的交互作用顯示，在液固比17∶1～18∶1、Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.02～0.04 mol/L范圍內(nèi)，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率響應(yīng)值可達最佳區(qū)域。且提取率隨著液固比及Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度的增加先升高后降低。圖3和圖4顯示蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率隨pH值的升高而增大，但是幅度不大。從以上3個圖可知提取液濃度和液固比對應(yīng)的曲面比較陡峭，說明這兩個因素相對結(jié)果影響顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。結(jié)合響應(yīng)面及等高線圖可知，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率的最佳取值范圍位于Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.02～0.04 mol/L、液固比17∶1～18∶1、pH 10.1～10.5。為了進一步確定變量的最佳取值點，通過Design-Expert 8.0.5b軟件的Optimization功能，計算得到蛋白質(zhì)提取率有最大響應(yīng)值時3 個因素的取值，即Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03mol/L、液固比17.51∶1、pH 10.5，該條件預(yù)測條件下的蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率為93.687 7%。

在修正后的最優(yōu)條件Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03 mol/L、液固比17.5∶1、pH 10.5、提取溫度20 ℃、提取時間1 h、攪拌間隔時間10 min、超聲時間7.5 min條件下進行3 次驗證實驗，測得蛋白質(zhì)的提取率為93.38%，比預(yù)測值略低，說明用該回歸方程分析所獲得的優(yōu)化提取條件是可信的。

3 結(jié) 論

通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、響應(yīng)面試驗獲得磨皮粉蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)條件是Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03 mol/L、液固比17.5∶1、pH 10.5、提取溫度20 ℃、提取時間1 h、攪拌間隔時間10 min、超聲時間7.5 min，此時蛋白質(zhì)提取率可達93.38%。

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Optimization of Extraction Process for Peel Waste Protein from Lotus Seeds by Response Surface Methodology

HE Wei, LIU Yongle*, WANG Faxiang
(College of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

A large amount of red lotus peel waste, which contains abundant nutrients, is produced during mechanical peeling of red lotus seeds. Accordingly, insufficient utilization of this byproduct is a serious waste of resource. The present study examined the impact of various factors on the extraction efficiency of protein from lotus seed peel waste by the combined use of Plackett-Burman design, steepest ascent design and response surface methodology. We found that 0.03 mol/L Na2CO3-NaHCO3buffer solution at pH 10.5 was the best solvent for the extraction of lotus seed peel waste protein. A solvent-to-solid ratio of 17.5:1, an extraction temperature of 20 ℃ and 1 h extraction proved optimal, resulting in an extraction yield of 93.38%.

lotus seed； peel waste； protein； response surface analysis

TS201.6；TS207.4

A

1002-6630（2015）08-0024-05

10.7506/spkx1002-6630-201508005

2014-09-26

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B08）

賀偉（1989—），女，碩士研究生，研究方向為大宗農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：583346178@qq.com

*通信作者：劉永樂（1962—），男，教授，博士，研究方向為大宗農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：1y1e19@163.com