李向紅，劉永樂(lè)*，俞 健，王發(fā)祥，王建輝，劉美宏

蓮子磨皮粉中蛋白質(zhì)的提取、組成及性質(zhì)

李向紅，劉永樂(lè)*，俞 健，王發(fā)祥，王建輝，劉美宏

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程系，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410114）

采用堿溶酸沉法提取蓮子磨皮粉中的蛋白質(zhì)，并以蓮子中提取的蛋白質(zhì)作對(duì)照，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、體積排阻色譜法測(cè)定了兩種蛋白質(zhì)的組成差異，采用差示掃描量熱儀及傅里葉紅外光譜對(duì)兩種蛋白質(zhì)的部分性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。結(jié)果顯示：堿溶酸沉法提取蓮子磨皮粉和蓮子蛋白質(zhì)的提取率分別為72.24%和78.93%；凝膠電泳圖譜顯示，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量分布在15～70 kD，而蓮子蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量分布在10～45 kD；體積排阻色譜圖譜也顯示蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)中包含有更多的不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)組分；差示掃描量熱儀分析顯示，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的變性峰值溫度為118.28 ℃，蓮子蛋白質(zhì)為108.05 ℃，且蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)變性焓值更高，因而蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)有序性較高；傅里葉紅外光譜分析也揭示蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)相比于蓮子蛋白質(zhì)構(gòu)象更為有序。

蓮子；蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)；分子性質(zhì)

蓮是我國(guó)特產(chǎn)，全國(guó)種植面積達(dá)2.1344×105hm2；2012年我國(guó)蓮子總產(chǎn)量達(dá)120萬(wàn) t以上，占國(guó)際貿(mào)易量的90%以上[1]。蓮的籽、殼、皮、芯、蓬等均具有較高的食或藥用價(jià)值[2-4]，然而，我國(guó)蓮子加工產(chǎn)品85%以上為初加工品，主要利用部分為蓮子肉，如通芯白蓮、開(kāi)邊湘蓮、圓粒湘蓮、鉆心湘蓮等。工業(yè)上通常采用機(jī)械磨皮的方式去掉蓮子的種皮得到白凈細(xì)滑的蓮子肉出售，加工中會(huì)產(chǎn)生約占原料質(zhì)量15%的磨皮粉，其中包含了豐富的蛋白質(zhì)、淀粉及其他功能物質(zhì)。目前這些副產(chǎn)物多被用作低值的肥料和動(dòng)物飼料，或者當(dāng)作垃圾被丟棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[5-6]。目前，有些研究?jī)H是針對(duì)蓮子中蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化[2,5]，或者對(duì)蓮子磨皮粉中功能性成分進(jìn)行綜合提取[6]，鮮少有研究對(duì)蓮子磨皮粉中蛋白質(zhì)進(jìn)行提取并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行表征。而對(duì)蓮子磨皮粉中蛋白質(zhì)進(jìn)行回收利用可能顯著提高蓮子加工的產(chǎn)值。本研究對(duì)蓮子磨皮粉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了提取，并對(duì)其組分、性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一定研究，可為蓮子加工副產(chǎn)物的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子磨皮粉由湖南粒粒珍湘蓮有限公司提供。

十二烷基磺酸鈉、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白、丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴酚藍(lán) 汕頭市西隴化工廠(chǎng)有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，所有化學(xué)試劑均為市售分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SK-1型快速混勻器 金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)；LG10-24A高速離心機(jī) 北京金立離心機(jī)有限公司；FD-1真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；迷你型垂直電泳槽、YY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠(chǎng)；LC-20A高效液相系統(tǒng) 日本島津公司；Q2000型差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC） 美國(guó)TA儀器公司；6700型傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取

在前期研究[7]的基礎(chǔ)上，采用堿溶酸沉法提取蓮子磨皮粉及蓮子中的蛋白質(zhì)。稱(chēng)取一定量過(guò)200 目篩的干燥粉末，以1∶20的料液比加入提取液（蒸餾水），調(diào)節(jié)pH值達(dá)11.0，40 ℃條件下攪拌提取2 h后以 8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液，棄去殘?jiān)?，調(diào)節(jié)上清液pH值為4.5，再以8 000 r/min離心15 min后得到沉淀，用蒸餾水將沉淀洗滌幾次，將溶液回調(diào)pH值到7.0，進(jìn)行冷凍干燥，得到干燥蛋白粉，4 ℃貯藏備用。

1.3.2 常規(guī)成分檢測(cè)

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[8]凱氏定氮法，氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)為6.25；水分含量的測(cè)定：采用GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》[9]直接干燥法；灰分含量的測(cè)定：采用GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》[10]干法灰化法。

1.3.3 蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定

將干燥后的蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)分別稱(chēng)質(zhì)量，結(jié)合凱氏定氮法測(cè)得這些提取物和所投原料中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，然后按如下公式計(jì)算其提取率：

1.3.4 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取蛋白粉5 g，溶于50 mL水中，并用0.5 mol/L HCl（和/或NaOH）溶液調(diào)節(jié)pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，放置1 h，再以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min后收集上清液。在波長(zhǎng)280 nm處進(jìn)行紫外檢測(cè)，測(cè)得最小吸光度處的pH值即為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。

1.3.5 蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量的測(cè)定

采用Laemmli垂直板十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）法[11]測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12% ，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%；以分子質(zhì)量64×104～14×104kD的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。1.3.6 蛋白質(zhì)組分的分子質(zhì)量測(cè)定

將蛋白質(zhì)用磷酸鹽緩沖液（2% SDS，pH 7.0）溶解配制成5 mg/mL的分散液，8 000 r/min離心15 min后取上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，使用Shodex KW-804蛋白柱分析蛋白樣品的分子質(zhì)量分布。流動(dòng)相為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（2% SDS，pH 7.0），洗脫速率1 mL/min，在280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)洗脫液，柱溫為20 ℃。

1.3.7 蛋白質(zhì)分子熱力學(xué)性質(zhì)分析[12]

采用DSC對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行熱力學(xué)性質(zhì)分析：氮?dú)饬魉?0 mL/min、掃描溫度范圍30～120 ℃、升溫速率10 ℃/min。另取一個(gè)空樣品盤(pán)，作為標(biāo)準(zhǔn)物，試樣及標(biāo)準(zhǔn)的稱(chēng)量誤差控制在0.2 mg范圍內(nèi)。

將待測(cè)物和標(biāo)準(zhǔn)物放入儀器中，蓋上蓋子和玻璃罩，開(kāi)始加熱，并用計(jì)算機(jī)繪制圖形。

1.3.8 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）分析[13]

采用紅外吸收光譜測(cè)定蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)方法如下：取一定量的干燥蛋白樣品與干燥的溴化鉀在瑪瑙研缽中充分研磨后混勻壓片，采用純溴化鉀片為本底，4 000～400 cm-1掃描樣品晶片，測(cè)定得到紅外吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)提取物的常規(guī)成分含量

表 1 常規(guī)成分含量檢測(cè)結(jié)果（干基）Table 1 Proximate composition of protein samples (dry base) %

從表1可見(jiàn)，采用堿溶酸沉法所提的蓮子蛋白質(zhì)提取物的蛋白含量略高，灰分含量較低。

2.2 蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)的提取率

采用堿溶酸沉法測(cè)定的蓮子蛋白質(zhì)提取率為78.93%，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率為72.24%。提取率均不高，所以此次實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的提取條件還沒(méi)有達(dá)到最佳，提取工藝有待進(jìn)一步優(yōu)化。

作為一個(gè)理性的主體，政府同時(shí)兼具自利性和公共性的特征。?自利性源于政府官員的自利性和團(tuán)隊(duì)的意志，公共性則源于政府存在的理由。為了實(shí)現(xiàn)公共利益，地方政府不僅需要在短期內(nèi)推動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，還需要打造地方發(fā)展的核心競(jìng)爭(zhēng)力，為地方長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展構(gòu)建持續(xù)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。這個(gè)公共性促使地方政府往往具備內(nèi)在發(fā)展需求，制度擴(kuò)散的內(nèi)部決定模型認(rèn)為內(nèi)在發(fā)展需求是驅(qū)動(dòng)城市采納先進(jìn)制度并進(jìn)行創(chuàng)新的主要?jiǎng)右?，通過(guò)吸納更多人才，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型，提升公共服務(wù)能力，構(gòu)成了地方政府進(jìn)行人才政策創(chuàng)新的內(nèi)驅(qū)力。

2.3 蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)等電點(diǎn)

蛋白質(zhì)是一種兩性物質(zhì)，等電點(diǎn)時(shí)分子間的靜電斥力理論上為零，實(shí)際上蛋白質(zhì)間靜電排斥作用最低，從而促使蛋白質(zhì)聚集、沉淀，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液的吸光度降為最小。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)常作為提取操作pH值的選取參考。

圖 1 蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果Fig.1 Isoelectric pointsof LSP and LSPP

由圖1可以看出，蓮子蛋白質(zhì)溶液經(jīng)不同pH值沉淀后，在pH 4.5處的吸光度最小，即得到的沉淀最多，上清液最澄清，而在其他pH值處的吸光度均比pH 4.5處的大，因此，可以判定蓮子蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI為4.5。同理，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI為5.0。與之前進(jìn)行酸沉?xí)r選取的等電點(diǎn)相比，蓮子蛋白質(zhì)提取選取pH 4.5較為恰當(dāng)，而蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)選取pH 4.5作為酸沉處理的pH值，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀不完全，這可部分說(shuō)明2.2節(jié)中所述結(jié)果中蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率低于蓮子蛋白質(zhì)提取率的原因。因此，在以后蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的提取中，酸法沉淀時(shí)取pH 5.0較佳。

2.4 蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量

2.4.1 蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析

圖 2 蓮子蛋白質(zhì)及蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE profiles of LSPP and LSP

由蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜（圖2）結(jié)合Gel-Pro Analyzer軟件分析圖譜結(jié)果可知，蓮子蛋白質(zhì)主要顯示出5 條亞基，分子質(zhì)量分布在10～45 kD范圍內(nèi)，其中分子質(zhì)量24.7 kD泳帶較粗，分子質(zhì)量在39.6 kD的蛋白質(zhì)亞基次之，可推知這兩種分子質(zhì)量的亞基是蓮子蛋白質(zhì)主要亞基；蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)主要顯示出7 條亞基，分子質(zhì)量分布在15～70 kD范圍內(nèi)，分子質(zhì)量在23 kD為該蛋白主要亞基。蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)的主要亞基都集中在25 kD附近。

2.4.2 蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)的體積排阻色譜分析

圖 3 蓮子蛋白質(zhì)（a）及蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)（b）體積排阻色譜Fig.3 SEC-HPLC chromatograms of LSP and LSPP

2.5 蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)的熱力學(xué)性質(zhì)通過(guò)對(duì)兩種蛋白的DSC圖譜分析得到蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)的變性溫度及變性焓值，結(jié)果見(jiàn)表2。蓮子蛋白質(zhì)開(kāi)始變性溫度和峰值溫度分別為64.79 ℃和108.05 ℃，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)兩個(gè)溫度為64.79 ℃和118.28 ℃。兩種蛋白在100～120℃范圍內(nèi)的焓變比較明顯，說(shuō)明此溫度條件下變性的蛋白為樣品的主要蛋白組分。蓮子蛋白質(zhì)DSC圖譜中出現(xiàn)的峰值溫度108.05 ℃比蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的峰值溫度118.28 ℃低，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的焓變

表 2 蓮子蛋白質(zhì)及蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的開(kāi)始變性溫度（T0）、峰值溫度（Tm）及變性焓值（△ H)Table 2 Onset (T0) and maximum (Tm) temperatures for endothermic transitions and net heat energy (enthalpy, △H ) required for these transitions for LSP and LSPP

6.49 J/g比蓮子蛋白質(zhì)的焓變值3.35 J/g高，表明蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)有序性較高于蓮子蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)。已有有關(guān)研究[14-15]說(shuō)明，ΔH值的增加反映了蛋白質(zhì)在升溫過(guò)程中的綜合吸熱效應(yīng)，例如氫鍵的斷裂等，其值的高低與蛋白質(zhì)內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)的有序性有關(guān)。

2.6 蓮子及其磨皮粉蛋白質(zhì)的FT-IR分析

圖 4 蓮子蛋白質(zhì)（a）及蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)（b）的FT-IR圖Fig.4 Infrared spectra of LSP and LSPP

蛋白質(zhì)空間構(gòu)象是影響其功能性質(zhì)的關(guān)鍵因素[16]。因此，對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)等空間構(gòu)象進(jìn)行詳細(xì)研究能較好地了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。FT-IR是最好的研究蛋白質(zhì)構(gòu)象工具之一[17-18]，如圖4所示，通過(guò)對(duì)比可知，二者的吸收峰位置基本一致，但有一定的細(xì)微區(qū)別。二者在1 300～1 000 cm-1范圍內(nèi)均有兩個(gè)吸收峰，其中前者和后者分別在1 125.31 cm-1和1 091.03 cm-1處有一個(gè)寬的吸收帶，這是二者出現(xiàn)相同吸收帶的波數(shù)差別相對(duì)較大之處，該寬吸收帶是由于C—O伸縮振動(dòng)引起；此外，二者均在1 400 cm-1處有一個(gè)尖銳的吸收峰，它是由于C—H鍵彎曲振動(dòng)引起[19]；譜帶范圍在1 700～1 600 cm-1的酰胺Ⅰ區(qū)用于分析兩種蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[20-21]，采用高斯曲線(xiàn)擬合酰胺Ⅰ區(qū)峰形，采用Origin 7.5根據(jù)積分面積計(jì)算出各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，結(jié)果表明兩種蛋白質(zhì)中無(wú)規(guī)卷曲（1 641～1 649 cm-1）的相對(duì)含量差別顯著，蓮子蛋白質(zhì)中無(wú)規(guī)卷曲的相對(duì)含量為52.78%，明顯高于蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的無(wú)規(guī)卷曲的相對(duì)含量（34.22%），說(shuō)明蓮子蛋白質(zhì)的構(gòu)象更加柔韌及具有更高的延伸性，而蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的構(gòu)象更為有序，與DSC的結(jié)果相呼應(yīng)。

3 結(jié)3 論

本研究采用堿溶酸沉法提取了蓮子及其磨皮粉中的蛋白質(zhì)，并對(duì)兩種蛋白質(zhì)組分和部分性質(zhì)進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，在現(xiàn)有提取條件下，蓮子蛋白質(zhì)提取率為78.93%，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率為72.24%；蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI為5.0左右，蓮子蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI為4.5。SDS-PAGE結(jié)果顯示蓮子蛋白質(zhì)亞基分布在10～45 kD，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)亞基分布在15～70 kD，體積排阻色譜結(jié)果也顯示蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)中包含有更多不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)組分；DSC和FT-IR分析均揭示蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)相比于蓮子蛋白質(zhì)構(gòu)象更為有序。

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Extraction, Composition and Molecular Properties of Proteins from Lotus Seed Peel Powder

LI Xianghong, LIU Yongle*, YU Jian, WANG Faxiang, WANG Jianhui, LIU Meihong
(Hunan Provincial Engineering Technology Research Center of Aquatic Food Resources Processing, Department of Food and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

In the present study, lotus seed peelpowder protein (LSPP) and lotus seed protein (LSP) were extracted by alkali solubilization and isoelectric precipitation. Sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and size-exclusion high performance liquid chromatography (SEC-HPLC) were used to examine the differences in the composition of the extracted proteins. Differential scanning calorimetry (DSC) and Fourier transform infrared spectrometer (FT-IR) were used to characterize some properties and structures of LSPP and LSP. The results showed that the extraction rates of proteins from lotus seed peel powder and lotus seed were 72.24% and 78.93%, respectively. SDS-PAGE analysis revealed that the molecular weights of LSPP subunits were distributed in the range from 15 to 70 kD, while those of LSP in the range from 10 to 45 kD. SEC-HPLC also revealed that LSPP was composed of a larger number of molecular fractions than LSP. DSC analysis showed that denaturation peak temperatures of LSPP and LSP were 118.28 ℃ and 108.05 ℃, respectively, and the former had a higher enthalpy of denaturation. These results combined with FT-IR analysis results showed that the conformation of LSPP was more regular.

lotus seed； peel powder protein； molecular property

TS209

A

1002-6630（2015）08-0129-05

10.7506/spkx1002-6630-201508023

2014-09-13

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD31B08）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101214；31201427）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JJ4054；12JJ6028）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目（14B009）

李向紅（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品深加工與蛋白質(zhì)工程。E-mail：xianghongli@hotmail.com

*通信作者：劉永樂(lè)（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與大宗農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：lyle19@163.com