劉友華

新型瓊脂擴散法檢測食品中天然防腐劑ε-聚賴氨酸含量

劉友華

（福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002）

為分析食品中ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）含量，建立一種新型瓊脂擴散法，并對分析條件進行優(yōu)化，驗證在檢測食品中ε-PL含量時的有效性。結果表明，質量分數0.002%亞甲基藍、0.75%瓊脂、ε-PL溶液pH值為2.0、牛津杯加液量750 μL時檢測結果最佳。本方法允許檢測橙汁中ε-PL最低含量為2 mg/kg、糕點和豬肉火腿中最低為10 mg/kg。這種新型瓊脂擴散法具有操作簡便、使用成本低、專一性高等優(yōu)點，可以廣泛應用于ε-PL生產企業(yè)和食品工業(yè)。

ε-聚賴氨酸；檢測；瓊脂擴散法；亞甲基藍；牛津杯；食品

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是一種由鏈霉菌屬的微生物以非核糖體合成方式積累的聚氨基酸，它由人體必需氨基酸賴氨酸通過α-羧基和ε-氨基形成酰胺鍵連接而成[1-3]。由于ε-PL是聚陽離子物質，它能夠通過靜電作用吸附到微生物表面，破壞其細胞膜并進而影響微生物生長繁殖，因此它能夠抑制包括革蘭氏陽性菌、陰性菌、真菌在內的多種微生物的生長繁殖[4-7]。此外，ε-PL具有很好的水溶性、熱穩(wěn)定性，并且無異味[8-9]。基于上述生物活性以及毒理實驗證明的安全性[10-11]，ε-PL已經被允許作為食品防腐劑在日本、韓國、美國等多個國家添加使用，它在常見食品中的添加量為50～500 mg/kg[2]?，F在國內有多家科研單位進行ε-PL開發(fā)，其中幾家單位的ε-PL項目已成功完成中試。國家衛(wèi)生計生委于2014年4月批準ε-PL為食品添加劑新品種，添加量在150～250 mg/kg范圍之內。然而到目前為止，還鮮見國內外檢測食品中ε-PL含量的相關文獻報道，我國也尚未制定食品中ε-PL的檢測標準。為便于國家食品安全部門監(jiān)管ε-PL在食品中的使用和相關企業(yè)推廣ε-PL作為防腐劑在食品工業(yè)中應用，急需建立食品中ε-PL的檢測方法。

目前ε-PL的檢測方法均為檢測發(fā)酵液中的ε-PL而建立的，主要有比色法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12-14]。但比色法并不適合檢測食品中ε-PL含量，因為食品濁度通常很高，會影響比色測定。采用HPLC法來檢測食品中ε-PL含量時，由于食品組分復雜，發(fā)現HPLC法不易將ε-PL和食品組分分開，從而影響檢測的準確度，目前還在研究之中。瓊脂擴散法是一種常用的定量方法，它的原理為：待測物質在平板上擴散時，能形成明顯的擴散圈，擴散圈直徑與待測物質含量對數值呈線性關系[15-17]。近來，在探索ε-PL生產菌株篩選方法的過程中，Nishikawa等[18]發(fā)現，由于ε-PL和堿性染料亞甲基藍之間的靜電作用，當ε-PL在含有亞甲基藍的瓊脂平板上擴散時，能形成清晰的擴散圈，并且ε-PL質量濃度的對數值與上述擴散圈直徑之間有很好的線性關系?；谏鲜鲈肀緦嶒灲⒁环N新型瓊脂擴散法，并且對此方法檢測食品中ε-PL含量的適用性進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ε-PL標品Ⅰ（約40 個賴氨酸殘基，由Kitasatospora sp. NY 2-11發(fā)酵合成，純度98%）、ε-PL標品Ⅱ（約30個賴氨酸殘基，純度99%） 日本Chisso公司；Nisin浙江銀象生物工程有限公司；亞甲基藍 美國Sigma公司；橙汁 匯源集團有限公司；糕點 市購；豬肉火腿 雨潤控股集團。

1.2 儀器與設備

牛津杯（內徑（6.0±0.1） mm、外徑（7.8±0.1） mm、高（10±0.1） mm） 上海江星儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ε-PL儲備溶液的制備

精確稱取1 g ε-PL，溶解到100 mL溶劑中，5 mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH 4.0或pH 2.0，作為儲備液。使用時，此儲備液用pH 4.0或pH 2.0溶劑進一步稀釋到所需ε-PL質量濃度。儲備液在4 ℃條件下可保存1 周。

1.3.2 瓊脂擴散法

滅菌后，待含有質量分數0.002%亞甲基藍的瓊脂溶液冷卻到45 ℃，取10 mL瓊脂溶液以無菌操作的方式加到培養(yǎng)皿中（100 mm×15 mm），凝固后作為瓊脂平板。在瓊脂平板上等距離安放牛津杯。將240 μL樣品溶液加入各個牛津杯內，然后將平板轉移到培養(yǎng)箱，在30 ℃條件下進行擴散，實驗重復4 次。待牛津杯內的溶液擴散完畢，取下牛津杯，水平和垂直測量擴散圈直徑，并記錄平均值。

以ε-PL質量濃度對數值為自變量，相應的擴散圈直徑為因變量，按下式計算回歸直線方程：

Y=a×lgX＋b

式中：X為ε-PL溶液質量濃度/（mg/L）；Y為擴散圈直徑/mm；a為回歸直線斜率；b為回歸直線截距。

本檢測方法的準確度（被測量的測得值與其真值間的一致程度）以回歸直線的斜率判斷。斜率越大擴散性越好，反之越差。精密度（在規(guī)定條件下，對同一或類似被測對象重復測量所得示值或測得值間的一致程度）用來驗證在給定ε-PL質量濃度范圍內回歸方程的有效性，以回歸方程的回歸系數來判斷。標準曲線與Y軸截距可反映測定的靈敏度。

1.3.3 待測食品的處理

將待測食物浸泡20 min，均質后調節(jié)pH值為2.0，70 ℃加熱10 min，10 000 r/min離心10 min，然后收集上清液作為食物浸液進行ε-PL含量檢測。

1.4 數據處理

以ε-PL質量濃度對數值為自變量，對應的擴散圈直徑為因變量，進行線性回歸，計算回歸方程。通過單因素方差分析各參數（斜率、靈敏度、R2、回收率）的平均值和標準偏差，通過Turkey法進行對比分析，顯著性水平為P=0.05。所有的數據分析均采用Origin Profession 8.0軟件包進行。

2 結果與分析

2.1 評估瓊脂擴散法分析ε-PL含量

為研究食品中其他物質對瓊脂擴散法的影響，按表1制備各種物質溶液，以1.3.2節(jié)平板擴散法進行實驗，結果如表1所示；為研究擴散圈與ε-PL含量之間的線性關系，以蒸餾水為溶劑，配制一系列pH 4.0的ε-PL標準溶液（50、100、200、400、600、1 000 mg/L），對照為pH 4.0的蒸餾水，也在同樣條件下進行擴散。結果如圖1所示。

表 1 常見的防腐劑、金屬鹽、糖類物質、蛋白類物質在亞甲基藍瓊脂平板上的擴散Table 1 Diffusion of common preservatives, metal salts, saccharides,and proteins on agar plate containing methylene blue mm

ε-PL是一種聚陽離子物質，而亞甲基藍是一種陽離子染料，當ε-PL在含有亞甲基藍的瓊脂平板上擴散時，由于ε-PL和堿性染料之間的靜電排斥作用，可觀測到擴散圈。結果如表1所示，L-賴氨酸（ε-PL的單體）、常用食品防腐劑以及其他物質均不會形成擴散圈。而ε-PL標品Ⅰ和ε-PL標品Ⅱ均形成清晰的擴散圈，并且兩者之間的擴散圈直徑差異不顯著（P＞0.05），說明ε-PL分子質量對擴散圈直徑影響不明顯。如無特殊說明，以下實驗均采用ε-PL標品Ⅰ作為ε-PL樣品。

如圖1a所示，隨著ε-PL質量濃度的增加，擴散圈直徑逐漸增大，而對照沒有擴散圈形成。在采用微生物瓊脂擴散法檢測Nisin過程中，Nisin在接種指示菌的平板上擴散時，會形成清晰的抑菌圈，并且Nisin質量濃度的對數值和抑菌圈直徑之間有線性關系[16-17]。因此，對上述擴散圈直徑和ε-PL質量濃度對數值進行線性回歸分析，發(fā)現直線的回歸系數達到0.996 8，說明兩者之間有很好的線性關系（圖1b）。

圖 1 1 ε-PL在亞甲基藍瓊脂平板上的擴散作用Fig.1 Diffusion of ε-PL on agar plate containing methylene blue

2.2 瓊脂擴散法分析條件的優(yōu)化

分析食品中ε-PL需要較高的靈敏度，而初始的分析條件不能滿足上述要求。參考微生物瓊脂擴散法定量Nisin中的主要影響因素[15,17]，選擇不同質量分數的亞甲基藍、瓊脂、瓊脂厚度、ε-PL溶液的pH值、牛津杯加液量為影響因素，優(yōu)化瓊脂擴散法檢測食品中ε-PL的分析條件。

2.2.1 亞甲基藍質量分數對瓊脂擴散法的影響

將一系列pH 4.0的ε-PL標準溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在分別含有不同質量分數亞甲基藍（0.001%、0.001 5%、0.002%、0.003%、0.004%）的平板上進行擴散。結果如表2所示。

表 2 亞甲基藍質量分數對瓊脂擴散法的影響Table 2 Effect of methylene blue concentration on agar diffusion assay

擴散前，含有質量分數0.001%以上亞甲基藍的平板顏色均為藍色。擴散后，質量分數0.001%和質量分數0.001 5%亞甲基藍平板上形成不清晰的擴散圈（邊緣模糊）。推測可能0.001%和0.001 5%亞甲基藍平板含有的正電荷染料太少，不能完全抵抗ε-PL的靜電排斥作用，一些亞甲基藍分子移動較快，而一些亞甲基藍分子移動較慢，因此導致擴散圈邊緣不清晰。

不同亞甲基藍質量分數對應的斜率之間并沒有顯著差異（P＞0.05），因此不同亞甲基藍質量分數不會影響該方法的準確度。另一方面，發(fā)現隨著亞甲基藍質量分數的增加，靈敏度明顯的下降。不同質量分數亞甲基藍之間擴散時間的差異不大，均為16 h。因此，選擇質量分數0.002%亞甲基藍為瓊脂擴散法檢測發(fā)酵液和食品中ε-PL含量時的分析條件。

2.2.2 瓊脂質量分數對瓊脂擴散法的影響

將一系列pH 4.0的ε-PL標準溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在分別含有不同質量分數的瓊脂（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、2.00%）平板上進行擴散。結果如表3所示。

當瓊脂質量分數不小于0.75%時，平板上均形成了清晰的擴散圈；而對于瓊脂質量分數為0.50%的平板，此條件下由于部分瓊脂發(fā)生液化，導致擴散圈不清晰。隨著瓊脂質量分數的增加，回歸直線斜率（彼此差異顯著，P＜0.05）逐漸下降（表3），因此降低瓊脂質量分數會增加瓊脂擴散法的準確性。而隨著瓊脂質量分數的減少，靈敏度逐漸增加；和2.00%瓊脂相比，0.75%瓊脂靈敏度增加了236.5%。除了質量分數0.75%瓊脂的擴散時間為18 h，其他質量分數瓊脂的擴散時間均為16 h。質量分數0.75%瓊脂具有高的靈敏度和準確度，因此選擇作為檢測食品中ε-PL含量時的分析條件。

2.2.3 瓊脂厚度對瓊脂擴散法的影響

將一系列pH 4.0的ε-PL標準溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在分別裝有不同體積瓊脂溶液（10、15、20、25、30 mL）的平板上進行擴散。結果如表4所示。

表 4 瓊脂厚度對瓊脂擴散法的影響Table 4 Effect of agar depth on agar diffusion assay

如表4所示，不同瓊脂厚度對應回歸直線斜率之間差異不顯著（P＞0.05），因此瓊脂厚度不會影響該方法的準確度。然而，隨著瓊脂厚度的減小，靈敏度顯著增加。和20 mL瓊脂溶液相比，10 mL瓊脂溶液的靈敏度增加了206%。15～30 mL瓊脂溶液的擴散時間均為16 h，而10 mL瓊脂溶液的擴散時間略微延長，為18 h。10 mL瓊脂溶液是能夠形成瓊脂平板的最小瓊脂溶液體積，它具有高的靈敏度和準確度，因此選擇作為檢測食品中ε-PL含量時的分析條件。

2.2.4 ε-PL溶液pH值對瓊脂擴散法的影響

配制pH值分別為2.0、3.0、4.0、6.0、8.0的5 種ε-PL標準溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在平板上進行擴散。

ε-PL的等電點為9.0[19]，當ε-PL溶液pH低于9.0時，它會攜帶大量的正電荷，并且隨著pH值降低，其所帶正電荷的數量逐漸增加。因此ε-PL溶液的pH值會顯著影響其在瓊脂平板上形成的擴散圈大小。如表5所示，pH 4.0和pH 6.0的斜率之間沒有顯著差異；但是，和pH 4.0相比，pH 2.0、3.0、8.0的斜率顯著下降（P＜0.05）。另一方面，隨著pH值下降，靈敏度顯著增加，特別是pH值從3.0降到2.0，靈敏度增加了94.5%。并且擴散時間均為16 h，回歸直線的R2值均較高，說明pH值對瓊脂擴散法的擴散時間和精密度影響不明顯。ε-PL的pH值低于2.0時，易發(fā)生降解，綜合考慮選擇pH 2.0作為檢測食品中ε-PL含量時的分析條件。

表 5 5 ε-PL溶液pH值對瓊脂擴散法的影響Table 5 Effect off ε-PL solution pH on agar diffusion assay

2.2.5 牛津杯加液量對瓊脂擴散法的影響

配制一系列pH 4.0的ε-PL標準溶液（50、100、200、300、400、600、800 mg/L），然后將250、500、750、1 000、1 250 μL ε-PL溶液分別在瓊脂平板上擴散。由于牛津杯的最大加液量為250 μL，當加液量超過250 μL時，首先牛津杯中加入250 μL ε-PL溶液，擴散完后，再次加入250 μL，直到擴散完一定體積的ε-PL溶液。

表 6 牛津杯加液量對瓊脂擴散法的影響Table 6 Effect off ε-PL solution volume added to Oxford cup on agar diffusion assay

如表6所示，各牛津杯加液量的斜率均顯著不同（P＜0.05），隨著牛津杯加液量增加，斜率顯著上升，擴散時間逐漸延長，同時靈敏度顯著增加（P＜0.05）。但隨著牛津杯加液量增加，R2有所下降。一個可接受的回歸直線，其R2應該不小于0.98，因此盡管1 000 μL和1 250 μL牛津杯加液量有較高的靈敏度，但并不適合作為檢測條件。綜合靈敏度和精密度考慮，選擇750 μL作為檢測食品中ε-PL含量時的分析條件。

2.2.6 瓊脂擴散條件的驗證

為驗證上述優(yōu)化的檢測食品中ε-PL條件的有效性，將750 μL一系列pH 2.0的ε-PL標準溶液（2、3、5、10、15、20、25、35、50 mg/L）在瓊脂平板（質量分數0.002%亞甲基藍、0.75%瓊脂、瓊脂溶液量10 mL）上進行擴散。

圖 2 2 ε-PL標準溶液在不同分析條件下的回歸直線Fig.2 Regression lines for ε-PL standards diffused under initial assay conditions

圖2 顯示了在初始和優(yōu)化分析條件下，ε-PL標準溶液相對應的回歸直線。優(yōu)化的檢測食品中ε-PL條件的準確度比初始條件增加了4.3%，檢出限從36.11 mg/L提升到1.64 mg/L。優(yōu)化的檢測食品中ε-PL條件的R2值為0.989 6，說明此條件下也具有較高的精密度。由以上數據推測，在上述優(yōu)化的分析條件下，瓊脂擴散法可以高靈敏度檢測食品中ε-PL含量。

相比于Itazhaki比色法和HPLC法，目前瓊脂擴散法具有簡便、靈敏度高的優(yōu)點。Itazhaki比色法檢測時間雖短，但是檢測結果重復性差，并且由于食品大多有一定的濁度，此方法不適合測定食品中的ε-PL含量。HPLC法雖然重復性好，檢測迅速，由于ε-PL與蛋白質的性質相近，不易將其與蛋白類似物質完全分開；此外HPLC法使用成本較高，不適合多數企業(yè)用戶的使用。

2.3 瓊脂擴散法檢測食品中ε-PL含量

為研究瓊脂擴散法檢測食品中ε-PL含量的有效性，選擇了3 種食品進行實驗。橙汁用來代表液體食物，糕點用來代表固體淀粉質食物，豬肉火腿用來代表固體蛋白類食物。

2.3.1 食品組分對ε-PL在瓊脂平板上擴散的影響

稱取5 g糕點或豬肉火腿加到20 mL蒸餾水中，經處理，收集上清液。分別以蒸餾水、橙汁、5倍稀釋糕點浸液、5 倍稀釋豬肉火腿浸液為溶劑，制備一系列ε-PL標準溶液（2、3、5、10、15、20、25 mg/L）。結果如圖3所示。

圖 3 不同溶劑制備的ε-PL標準溶液相應的回歸直線Fig.3 Regression curves calculated from the diffusion of ε-PL standards on agar plates

以蒸餾水、橙汁、5 倍稀釋糕點浸液、5 倍稀釋豬肉火腿浸液為溶劑制備的ε-PL標準溶液相應回歸直線的R2值分別為0.988 2、0.991 3、0.990 6和0.985 6，這說明在2～25 mg/L ε-PL質量濃度范圍，以食物浸液為溶劑時，擴散圈直徑和ε-PL質量濃度對數值之間也存在很好的線性關系。同時發(fā)現同樣質量濃度的ε-PL溶液，當以食物浸液為溶劑時，其擴散圈直徑小于蒸餾水為溶劑時的擴散圈直徑，推測可能食品中組分會阻擋ε-PL在瓊脂平板上擴散。因此，為補償食品組分對瓊脂擴散法的影響，應該以一定稀釋倍數不含ε-PL的食物浸液為溶劑制備ε-PL標準溶液，食品樣品稀釋相同的倍數，擴散后，食物樣品的ε-PL含量從ε-PL標準溶液相應的回歸直線計算得出。這種條件下，可以最低檢測橙汁中2 mg/kg ε-PL、糕點和豬肉火腿中10 mg/kg ε-PL。

2.3.2 食品中ε-PL含量的評估

取50 mg ε-PL加入1 L橙汁中，混勻后調pH 2.0；以pH 2.0蒸餾水為稀釋劑，將橙汁稀釋5、10、20 倍；然后橙汁和稀釋的橙汁溶液分別按上述步驟進行預處理；樣品溶液在瓊脂平板上擴散；最后樣品ε-PL含量從以蒸餾水為溶劑制備的ε-PL標準溶液相對應回歸直線計算得出。對于糕點和豬肉火腿，100 mg ε-PL直接和1 kg糕點或豬肉火腿均質，取5 g該食物，用pH 2.0蒸餾水分別稀釋5、10、20、30、40、50 倍。其他分析步驟和2.3.1節(jié)相同。

當不能獲得未添加ε-PL的食物時，若從以蒸餾水為溶劑制備的ε-PL標準溶液相應回歸直線計算食物中ε-PL含量，會導致結果偏小。推測上層食品組分對ε-PL瓊脂擴散的影響是由于食品成分高導致的，若適當稀釋食物樣品，可能能夠減小食品組分對瓊脂擴散分析的影響。對上述假設的有效性進行驗證，結果如表7所示。

表 7 瓊脂擴散法檢測食品中ε--PPLL含量Table 7 Estimation off ε-PL in foods by agar diffusion assay mg/kg

由表7可知，隨著稀釋倍數的增加，食物中的ε-PL回收量逐漸上升，但當橙汁的稀釋倍數高于5 倍、糕點的稀釋倍數高于20 倍和豬肉火腿的稀釋倍數高于30 倍時，ε-PL回收量變化不顯著（P＞0.05）。橙汁和蛋糕的ε-PL最大回收率高于95%，而豬肉火腿的最大回收率略低，為91.77%。豬肉火腿中較低的ε-PL回收量可能是由蛋白類物質對ε-PL的強烈吸附作用造成的，在微生物瓊脂擴散法定量高蛋白食品中Nisin（一種多肽類防腐劑）含量時也發(fā)現類似現象[20]。以上數據證明了上述假設的正確性，即食品中ε-PL含量也可以通過以下步驟檢測：根據待檢食物樣品的特點，將樣品稀釋到適當的倍數，例如液體飲料稀釋5 倍，淀粉質食品稀釋20 倍，而蛋白類食物稀釋到30 倍；預處理后，食物浸液在瓊脂平板上擴散；最后從以蒸餾水為溶劑標準溶液相應的回歸直線計算食物樣品中ε-PL的含量。

3 結 論

瓊脂擴散法分析食品中ε-PL的最佳分析條件為：質量分數0.002%亞甲基藍、0.75%瓊脂、ε-PL溶液pH值為2.0、牛津杯加液量750 μL。食品成分會影響ε-PL在瓊脂平板上的擴散，但這種干擾作用能夠通過稀釋樣品的方式消除。通過適當的制備ε-PL標準溶液或稀釋樣品溶液，這種新型瓊脂擴散法能夠可靠地定量檢測橙汁中最低2 mg/kg ε-PL、糕點和豬肉火腿中10 mg/kg ε-PL。

由于這種新型瓊脂擴散法具有操作簡便、使用成本低、專一性高等優(yōu)點，因此可以用于ε-PL生產企業(yè)、食品工業(yè)以及其他ε-PL相關科學研究中ε-PL的檢測。理論上，推測這種方法也可以用來檢測其他聚陽離子物質，如聚精氨酸。此外，聚陰離子物質，如γ-聚谷氨酸（另一種微生物合成的另一種聚氨基酸），可能也可以用類似原理進行檢測。因此，這種新型瓊脂擴散法也為定性、定量其他聚陽離子和聚陰離子物質提供了一種新的研究思路。

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A Novel Agar Diffusion Assay for Qualitative and Quantitative Estimation of ε-Polylysine in Foods

LIU Youhua
(Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, Fuzhou 350002, China)

A novel agar diffusion assay was developed, optimized, and validated for the analysis of ε-polylysine (ε-PL) in foods. Re sults showed that the optimum assay conditions were 0.75% agar, 0.002% methylene blue, pH of ε-PL solution adjusted to 2.0 and 750 μL of ε-PL solution allowed to diffuse on agar plate. This method allowed detection of ε-PL at levels as low as 2 mg/kg in orange-juice, and 10 mg/kg in cake and pork ham. This proposed agar diffusion assay can be widely used in ε-PL-production and food industry because of its simplicity, cost-effectiveness, and high specificity.

ε-polylysine； determination； agar diffusion assay； methylene blue； Oxford cup； food

TS207.3

A

1002-6630（2015）08-0225-06

10.7506/spkx1002-6630-201508042

2014-08-26

福建省科技計劃重點項目（2014Y0015）

劉友華（1963—），男，高級工程師，學士，研究方向為食品檢測與發(fā)酵工程。E-mail：775729188@qq.com