李光宇 李永玲 張明曉

非線性化學(xué)指紋圖譜在大豆品種鑒定中的應(yīng)用

李光宇 李永玲 張明曉

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

市場上大豆種子品種多樣，質(zhì)量參差不齊，實現(xiàn)對大豆品種快速、準確、可靠地鑒定，對保障農(nóng)民利益及種子質(zhì)量管理有極為重要的意義。本文利用非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)結(jié)合模式識別的方法對10種常見的大豆品種進行了鑒定研究。結(jié)果表明：不同品種的大豆種子，其化學(xué)指紋圖譜的特征參數(shù)差異較大，在聚類分析及主成分分析中均能被準確分離鑒定；而屬同一品種下的不同批次的大豆種子，其圖譜特征參數(shù)差異較?。ㄗ畲笙鄬藴什顬?.3%），在聚類分析及主成分分析中均被成功歸為一類。因此，非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)是一種新型有效地鑒定大豆品種的分析方法。

B－Z振蕩反應(yīng) 大豆種子 品種鑒定 模式識別 非線性化學(xué)指紋圖譜

大豆含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、不飽和脂肪酸及B族維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，是植物蛋白的主要來源，也是世界上產(chǎn)量最多的油料作物。隨著農(nóng)業(yè)科技水平的進步與發(fā)展，越來越多的新型大豆品種被培育出來。新型大豆品種往往具備抗病蟲害能力強、產(chǎn)量大、營養(yǎng)價值高等優(yōu)良特性，具有更好的適應(yīng)性與經(jīng)濟性。然而，在種子品種多樣化、良種需求擴大化的過程中，假種子問題也日益顯現(xiàn)出來。假大豆種子通常采用以次充好的方法冒充優(yōu)良品種，更有甚者，直接使用商品食用大豆冒充大豆種子進行銷售。假種子往往具有品質(zhì)差、產(chǎn)量低、不易及時發(fā)現(xiàn)等特點，流入市場則給農(nóng)民造成巨大的經(jīng)濟損失。

現(xiàn)有的大豆品種鑒定方法可分為三大類，即外觀形態(tài)的鑒定方法、生化性質(zhì)的鑒定方法以及DNA分子標記法。通過外觀形態(tài)進行鑒定的方法一般是通過觀察大豆的籽粒形態(tài)特征及幼苗枝葉特征等來判斷大豆品種［1－2］，這種方法簡單直觀，但不易區(qū)分一些外觀相似的大豆品種，另外，鑒定者的觀測經(jīng)驗也制約鑒定的準確性。利用生化性質(zhì)鑒定的方法目前常見的有同工酶電泳法［3］、蛋白質(zhì)電泳法［4－5］、高效液相色譜法［6－8］等，其中蛋白質(zhì)電泳法在大豆品種的鑒定上運用較為廣泛，該法先要提取出大豆中的水溶蛋白，再利用其差異性來辨別不同的大豆品種。DNA分子標記法鑒定結(jié)果較為準確，但所用儀器大都比較昂貴，對試驗技能也有較高要求，如AFLP［9－10］、RAPD［9，11－12］和SSR［13］技術(shù)等。由此可見，各種鑒定方法均有其獨特的優(yōu)勢，同時也存在自身的局限性。因此，有必要從多個角度發(fā)展不同的分析方法互相補充，進而實現(xiàn)對復(fù)雜生物樣品的更簡便、更快速、更準確的鑒定。非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)作為一種新型的分析方法，得益于其簡單的樣品預(yù)處理、便利的實驗操作、較低的儀器成本等優(yōu)點，近年來已在藥物檢測［14－16］及食品檢測［17－19］等方面得到初步研究與應(yīng)用，但用于農(nóng)作物品種鑒定方面的研究鮮見報道。本文旨在通過非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)，對10種常見的大豆品種進行分析與鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MXlab指紋圖譜儀［20］：實驗室自主研發(fā)，集數(shù)據(jù)采集、恒溫水浴、磁力攪拌等功能于一體；Q－250B高速多功能粉碎機：上海冰都電器有限公司；213型鉑電極：天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；小型硫酸銅電極：實驗室自制。

用超純水稀釋濃硫酸至1.0 mol／L，用稀釋后的硫酸溶液分別配制0.15 mol／L的丙二酸溶液和0.08 mol／L的硫酸鈰銨溶液。用超純水配制1.25 mol／L的溴酸鈉溶液。試驗中所用大豆種子由重慶市種子管理站提供，其中中黃37與東辛3號各5個生產(chǎn)批次，其他大豆品種各4個生產(chǎn)批次。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

取50.0 g大豆種子放入高速粉碎機粉碎30 s至粉末狀，并用80目篩網(wǎng)篩選。把無法通過篩網(wǎng)的大顆粒放入粉碎機中再次粉碎30 s后過篩。收集2次過篩后得到的樣品粉末并放入密封袋中恒溫（4℃）保存。

1.2.2 試驗步驟

量取50.0 mL丙二酸溶液加入反應(yīng)器，并調(diào)節(jié)水浴溫度至45℃，同時啟動電磁攪拌裝置。待溶液溫度恒定后，加入1.30 g大豆樣品。樣品分散均勻后，用移液槍依次加入1.0 mL溴酸鈉溶液和1.0 mL硫酸鈰銨溶液，同時以0.1 s的采樣間隔記錄反應(yīng)器中溶液的電勢隨時間的變化。當電勢振幅小于0.005 V時判定振蕩反應(yīng)已經(jīng)終止，保存化學(xué)指紋圖譜并清理實驗儀器。重復(fù)以上步驟，直至得到所有10個大豆品種的所有批次的42個樣品的化學(xué)振蕩指紋圖譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗原理

非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)是基于B－Z振蕩反應(yīng)的一種鑒定方法［21－22］。眾多學(xué)者對B－Z振蕩反應(yīng)的機理進行了研究，其中FKN模型被廣為接受［23－24］。在以H2SO4、（NH4）4Ce （SO4）4、CH2（COOH）2、NaBrO3構(gòu)成的振蕩體系中，鈰離子作為催化劑在Ce3＋與Ce4＋之間做周期性變化，從而導(dǎo)致溶液中電勢也隨之做周期性變化。試驗中以硫酸銅電極作為參比電極，以鉑電極作為工作電極就可以檢測出這種電勢變化。B－Z振蕩反應(yīng)包含20多個基元反應(yīng)，任意反應(yīng)進程的微小改變，都會造成總反應(yīng)進程的變化，因此B－Z振蕩體系對外界化學(xué)物質(zhì)具有較高的靈敏度。大豆種子作為一種復(fù)雜的生物樣品具有多種活性物質(zhì)，其化學(xué)組成中的氧化及還原性物質(zhì)可直接或間接的影響振蕩反應(yīng)進程，同時，由于不同大豆品種之間化學(xué)成分及其相對含量的差異，對振蕩反應(yīng)造成的影響也各不相同。記錄溶液中的電勢變化并以時間（t）為X軸、以電勢（E）為Y軸繪制出E－t曲線，即可得到包含豐富信息的非線性化學(xué)指紋圖譜（如圖1）。通過提取化學(xué)指紋圖譜中的特征參數(shù)對各大豆品種建立標準圖譜庫，再結(jié)合模式識別的方法就可以快速準確地鑒定出未知大豆種子的品種。

圖1 非線性化學(xué)指紋圖譜的獲取

2.2 圖譜的特征參數(shù)

從非線性化學(xué)指紋圖譜豐富的特征信息中提取出8個較為獨立的參數(shù)用于模式識別。各特征參數(shù)說明如下：最大電勢（Emax）、最大電勢處的時間（tmax）、最大振蕩波幅（ΔEmax）、第一個波谷的電勢（Eft）、最后一個波谷的電勢（Elt）、誘導(dǎo)時間（tind）、振蕩周期（τop）、振蕩壽命（toe）。獲取的10個大豆品種的非線性化學(xué)指紋圖譜并提取參數(shù)如表1所示。

表1 10種大豆的非線性化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)

由于不同品種的大豆所含化合物種類及相對含量差異較大，導(dǎo)致各品種的指紋圖譜特征參數(shù)差異明顯。如：灌豆1號的誘導(dǎo)時間最短，為161.3 s，而中黃25的誘導(dǎo)時間則較長，為248.5 s；中黃57具有較短的振蕩壽命，為784 s，而灌豆1號振蕩壽命長達1 416.6 s，幾乎是前者的2倍。利用這些數(shù)據(jù)的差異進行綜合分析，就可以準確地鑒別出不同的大豆品種。

2.3 樣品添加量

通過單因素試驗研究了樣品添加量對非線性化學(xué)指紋圖譜產(chǎn)生的影響。以振蕩時間最短的中黃25進行試驗，按照試驗步驟獲得不同樣品添加量下的大豆種子的非線性化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果如圖2所示。

圖2 樣品添加量對非線性化學(xué)指紋圖譜的影響

由圖2可知，隨著大豆樣品添加量的增加，其化學(xué)指紋圖譜的振蕩壽命及電勢振幅均出現(xiàn)明顯下降，當大豆樣品的添加量為1.5 g時，電勢振蕩被大幅抑制，圖譜特征殘缺不全，其特征參數(shù)已無法用于鑒定；當樣品添加量繼續(xù)加至1.7 g時，圖譜呈線狀，振幅被完全抑制而無法再發(fā)生電勢振蕩現(xiàn)象，圖譜失去幾乎所有特征，因此過多的樣品添加量不利于圖譜特征的表達。當大豆樣品的添加量不大于1.3

g時，化學(xué)指紋圖譜特征均可完整體現(xiàn)出來，但隨著樣品添加量繼續(xù)減少，振蕩壽命不斷增長，即鑒定所需的時間在不斷增加，而過長的鑒定時間是不利的也是不必要的，因此，在圖譜特征能完整反映的前提下，取振蕩壽命最短的大豆樣品添加量用于鑒定，即樣品添加量為1.3 g時是適宜的。

2.4 批次間差異性

大豆作為一種生物樣品，具有一定的個體差異性。我們以4個不同生產(chǎn)批次的徐豆14大豆種研究其非線性化學(xué)指紋圖譜之間的差異性。按照試驗步驟獲取指紋圖譜，并提取各特征參數(shù)后列于表2中。

表2 不同批次的大豆種子的化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)

從表2中可以看出，不同批次的徐豆14的圖譜特征參數(shù)差異較小，最大相對標準差為3.3%。這表明，大豆種子的化學(xué)組成較為穩(wěn)定，同一地區(qū)不同生產(chǎn)批次的大豆種子之間化學(xué)性質(zhì)相似，這便減少了對大豆標準圖譜建庫的工作量，有利于非線性化學(xué)指紋圖譜法的推廣與應(yīng)用。此外，不同生產(chǎn)批次的大豆種子的圖譜參數(shù)差異較小，也可間接表明非線性化學(xué)指紋圖譜法具有較好的穩(wěn)定性與重復(fù)性。

2.5 聚類分析

在軟件MATLAB中，用Z－Score的方法對化學(xué)指紋圖譜參數(shù)進行標準化處理，計算歐氏距離后做出聚類分析圖如圖3所示。

圖3 42個大豆樣品的聚類分析樹狀圖

由圖3可知，不同的大豆品種由于其特征參數(shù)的差異較大，在聚類分析樹狀圖中被成功地分為10大類，而不同批次的同一品種的大豆種子，由于特征參數(shù)差異較小，被分在同一分支下。此外，從聚類分析樹狀圖中亦可看出各品種的差異程度，例如：中黃13與中黃57在較上一級的分支中被歸為一類，這表明中黃13與中黃57特征參數(shù)差異較小，而在最上級的分支中所有樣品被劃分為兩大類，即臨豆類與其他樣品類，這表明臨豆樣品與其他大豆品種的化學(xué)組成間差異較大。由此可見，用聚類分析的方法即可實現(xiàn)對大豆品種的準確分類與鑒定。

2.6 主成分分析

用軟件MATLAB對8個特征參數(shù)進行降維處理并選取貢獻率最大的2個主成分作出主成分分析圖如圖4所示。從主成分分析圖中可以看出，同一品種的大豆樣品聚集在同一區(qū)域形成集團，并與其他大豆品種分離開來。同時，所有大豆樣品在圖中被準確分為10大類?？梢?，化學(xué)指紋主成分分析圖同樣可以直觀地展示出對大豆品種的鑒定情況。

各特征參數(shù)在主成分中的權(quán)重系數(shù)如圖5所示，主成分1貢獻率為55.20%，主成分2貢獻率為24.43%，前2個主成分累計貢獻率達79.64%。從各特征參數(shù)在圖中坐標分布可知，參數(shù)τop即振蕩周期對主成分1的影響最大，而tmax即最大電勢出現(xiàn)時間對主成分2的影響最大。

圖4 10種大豆的主成分分析圖

圖5 特征參數(shù)在主成分中的權(quán)重系數(shù)圖

3 結(jié)論

利用B－Z振蕩體系與大豆組分之間的相互作用而獲取特征唯一的非線性化學(xué)指紋圖譜。非線性化學(xué)指紋圖譜能夠間接地反映出大豆的整體化學(xué)特征，進而通過參數(shù)分析實現(xiàn)對大豆品種的準確鑒定。研究了隸屬于10個大豆品種的42個樣品的非線性化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果表明，使用聚類分析和主成分分析的方法均可準確鑒定出試驗中所有大豆品種。非線性化學(xué)指紋圖譜法具有樣品預(yù)處理簡單、鑒定速度快、儀器成本低等優(yōu)點，是一種應(yīng)用前途廣泛的分析方法。

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Application of Nonlinear Chemical Fingerprints Chromatography to Identification of Soybean Varieties

Li Guangyu Li Yongling Zhang Mingxiao
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest University，Chongqing 400715）

Soybean seeds varieties were developed increasingly while the seeds quality on the market was rather spotty.Looking for methods to identify soybean varieties efficiently was significant for seed quality management and safeguarding interests of farmers.This paper aimed to identify 10 kinds of soybean seeds by using nonlinear chemical fingerprints combined with pattern recognition methods.The results showed that characteristic parameters of soybean seeds of different varieties were quite different，and all samples could be accurately identified by cluster analysis and principal component analysis；the different batches of the same variety of soybean were successfully classified as a class since the similar characteristic parameters（the maximum relative standard deviation was 3.3%）.Therefore，nonlinear chemical fingerprint technology was a new analytical method to effectively identify soybean varieties.

B － Z oscillating reaction，soybean seeds，identification，pattern recognition，nonlinear chemical fingerprint

S－3

A

1003－0174（2016）08－0143－05

2014－12－15

李光宇，男，1990年出生，碩士，電分析化學(xué)

張明曉，男，1963年出生，教授，電分析化學(xué)