不同灸法艾灸血清對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的影響*

劉鰩1張付平1王蕾1馬文彬2劉旭光2李軒漾1周海燕2

(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)教研室， 四川 成都 610041；

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院， 四川 成都 610075；)

【摘要】目的探討不同灸法艾灸血清對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)滑膜成纖維細(xì)胞的影響，揭示不同艾灸方法對實(shí)驗(yàn)性RA抗炎效應(yīng)的作用機(jī)制。方法用直接灸、溫和灸、隔姜灸三種不同艾灸方法刺激實(shí)驗(yàn)性RA大鼠“腎俞”、“足三里”穴,收集血清，用艾灸血清作用于大鼠RA滑膜成纖維細(xì)胞,倒置顯微鏡觀察各細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果不同灸法“艾灸血清”培養(yǎng)RA模型大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞48h后，RA滑膜成纖維細(xì)胞狀態(tài)變好，其形態(tài)逐漸接近于正常滑膜成纖維細(xì)胞，其中以隔姜灸組最為明顯。結(jié)論艾灸治療有改善病理性炎性滑膜成纖維細(xì)胞生長狀態(tài)，可起到促進(jìn)其向正?；D(zhuǎn)歸的作用，不同灸法中以隔姜灸法治療效果最為明顯。

【關(guān)鍵詞】類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎； 直接灸； 溫和灸； 隔姜灸

【中圖分類號】R 245.81; R 593.32

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.002

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of different moxibustion serum on rheumatoid arthritis (RA) synovial fibroblasts and explore the mechanism of different moxibustion methods in treatment of experimental RA. MethodsDirect moxibustion, warm-moxibustion and ginger moxibustion methods were employed to stimulate the “Shenshu”(BL23)and “Zusanli”(ST36)regions of experimental RA rats. The serum of experimental RA rats was collected and used to culture RA synovial cells. Cell morphology was observed and recorded using inverted microscopy. ResultsThe morphology of RA synovial cells was gradually approach to normal synovial fibroblasts after culturing with different moxibustional serum for 48h. The ginger-partitioned moxibustion group had the most significant changes. ConclusionMoxibustional treatment can improve the RA synovial cell growth state and promote the RA synovial fibroblasts recovery. The ginger group has the most obvious effect.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81173319)

通訊作者：王蕾， E-mail：327867291@qq.com; Tel：13398193355；

收稿日期：( 2015-04-01； 編輯： 何興華)

Effect of different moxibustion serum on rheumatoid arthritis synovial fibroblastsLIU Yao1，ZHANG Fuping1, WANG Lei1，etal

(1.DepartmentofHistology,EmbryologyandNeurobiology，WestChinaSchoolofBasicand

ForensicMedicine，SichuanUniversity，Chengdu610041，China；

2.SchoolofAcupunctureandMassage，ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu610075，China)

【Key words】Rheumatoid arthritis； Direct moxibustion； Warm moxibustion； Ginger-partitioned moxibustion

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種以慢性對稱性多關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)為主的全身性自身免疫疾病。以滑膜增生、血管翳形成及軟骨與骨組織破壞為特征的滑膜炎癥是RA的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[1]。艾灸作為中醫(yī)傳統(tǒng)療法，對RA 的治療具有確切的療效[2],且不同灸法(傳統(tǒng)灸法大體上可分為直接灸、溫和灸、隔物灸三大類)具有不同的抗炎效應(yīng)。既往大量在體實(shí)驗(yàn)研究已從神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)途徑和滑膜細(xì)胞靶點(diǎn)效應(yīng)角度對艾灸治療RA的作用原理進(jìn)行了較深入的探索，但是艾灸及不同灸法對RA滑膜成纖維細(xì)胞作用的具體細(xì)節(jié)卻少見報(bào)道。在本文中，我們建立體外RA滑膜成纖維細(xì)胞模型，觀察不同灸法艾灸血清對實(shí)驗(yàn)性RA滑膜成纖維細(xì)胞的直接影響過程，為研究艾灸治療RA的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1動物與分組SPF級SD大鼠50只，體重(250±0.25)g，雌雄各半，由四川大學(xué)動物試驗(yàn)中心提供。

1.1.2主要試劑高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(Hyclone,美國);胎牛血清(Gibco，美國);福氏完全佐劑(FCA)、二甲基亞砜(均為美國Sigma公司產(chǎn)品)；血管細(xì)胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule，VCAM1)抗體、骨成型蛋白受體(Bone morphogenetic protein receptor，BMPR)抗體(Santa Cruz公司)、艾絨(南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠)。

1.2　方法

1.2.1RA模型建立SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、RA模型組、直接灸組、溫和灸組與隔姜灸組，每組10只。于實(shí)驗(yàn)開始第一天，將各組動物雙側(cè)膝關(guān)節(jié)周圍剃毛，用75%酒精消毒，輕度彎曲膝關(guān)節(jié)。模型組及艾灸組以膝關(guān)節(jié)髕骨下緣、髕韌帶外側(cè)凹陷為穿刺點(diǎn)，將FCA(0.5mL/kg)平均注射于雙后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，造成大鼠膝關(guān)節(jié)佐劑性關(guān)節(jié)炎，對照組采用相同方法注入等體積生理鹽水[3]。

1.2.2艾灸治療造模后第七天將艾灸組大鼠固定，暴露背部及膝關(guān)節(jié)(治療穴位部位剃毛2cm×2cm)。將艾絨制成的艾粒(5mg/壯)分別用直接灸(于艾粒底部涂少量凡士林固定于大鼠的穴位)，溫和灸(將艾粒點(diǎn)燃后對準(zhǔn)穴位，距離皮膚約5mm)，隔姜灸(將艾粒放在厚度約1mm，大小為2.5cm×2.5cm的姜片中央，待艾粒燃盡后移除再換上新的艾粒)三種不同方法施灸“腎俞”“足三里”穴(參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》的動物穴位圖譜)各5壯,雙側(cè)交替進(jìn)行，每日1次。6天為1療程,共治療3個(gè)療程,療程之間休息1天。正常對照組和模型組動物同法固定,但不治療。

1.2.3艾灸血清制備治療第21天,對正常對照組和各艾灸治療組動物心臟無菌取血,室溫靜置20min后1500r/min離心10min，取上清,同組血清混合、分裝,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4細(xì)胞原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、純化與鑒定治療21天后，處死對照組及模型組大鼠，在嚴(yán)格消毒的條件下打開雙后肢膝關(guān)節(jié)，用手術(shù)剪剪切位于關(guān)節(jié)腔內(nèi)側(cè)面的滑膜組織,放入盛有PBS(含青、鏈霉素各10萬u/L)的培養(yǎng)皿中,然后移至超凈工作臺，用PBS洗三遍后再用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基洗三遍。將組織剪成1cm×1cm×1cm的小塊植入3.5cm培養(yǎng)皿中，小塊間距約0.5cm均勻擺放，加入約500ul培養(yǎng)基剛好濕潤組織塊移至37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后補(bǔ)加培養(yǎng)基至2ml，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)原代細(xì)胞長至培養(yǎng)皿的80%以上時(shí)，用0.25%的胰酶消化后離心，重懸后傳代培養(yǎng)，當(dāng)傳至3～4代時(shí)，用VCAM、BMPR抗體進(jìn)行鑒定，取3～4代細(xì)胞液氮凍存，取3～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.5細(xì)胞形態(tài)觀察倒置顯微鏡觀察正?；こ衫w維細(xì)胞、RA炎性滑膜成纖維細(xì)胞、以及用各艾灸治療組血清培養(yǎng)48h后RA滑膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。

首先，全球林產(chǎn)品貿(mào)易格局將進(jìn)一步調(diào)整，未來傳統(tǒng)的勞動力密集型林產(chǎn)品、資本密集型林產(chǎn)品將逐步讓位于技術(shù)密集型林產(chǎn)品。特別是歐美發(fā)達(dá)國家利用其森林資源、市場、資本、管理和科技等方面的競爭優(yōu)勢，在高端產(chǎn)品領(lǐng)域?qū)⒗^續(xù)占據(jù)制高點(diǎn)，并在全球技術(shù)密集型林產(chǎn)品貿(mào)易中處于主體地位；而越南、柬埔寨發(fā)、緬甸、印尼等發(fā)展中國家將主要利用勞動力的價(jià)格優(yōu)勢在林產(chǎn)品國際貿(mào)易中搶占有利位置，成為中國的主要競爭對手;俄羅斯、南美、非洲和太平洋島國等將利用其森林資源優(yōu)勢，進(jìn)一步強(qiáng)化原木出口禁令，同時(shí)加快產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，林產(chǎn)品生產(chǎn)和貿(mào)易水平有望不斷提升。

2結(jié)果

2.1正?；こ衫w維細(xì)胞形態(tài)原代培養(yǎng)3d左右,倒置顯微鏡下可見組織塊邊緣有少量橢圓形、三角形或梭形細(xì)胞長出，7d后組織塊周圍有較明顯的成纖維細(xì)胞長出,以后逐漸增多并向四周呈放射樣生長。由于滑膜成纖維細(xì)胞在體外生長迅速，可抑制滑膜巨噬細(xì)胞的生長，經(jīng)傳代培養(yǎng)純化后，圓形的滑膜巨噬細(xì)胞逐漸消失,而以成纖維樣滑膜細(xì)胞生長為主，至第三代時(shí)成纖維樣細(xì)胞所占比例>90%，其細(xì)胞呈多邊形或長梭形，有兩個(gè)或多個(gè)突起(圖1a)。經(jīng)特異性抗體VCAM鑒定證實(shí)為滑膜成纖維細(xì)胞(圖1b)。

2.2RA炎性滑膜成纖維細(xì)胞形態(tài)與正?；こ衫w維細(xì)胞相比，RA炎性滑膜成纖維細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞邊緣不清晰，細(xì)胞突起變得不明顯，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀及空泡狀物質(zhì)(圖2a)。經(jīng)特異性抗體BMPR鑒定證實(shí)為RA炎性滑膜成纖維細(xì)胞(圖2b)。

圖1正常滑膜成纖維細(xì)胞

Figure 1The normal synovial fibroblasts

注：a.第三代滑膜成纖維樣細(xì)胞呈多邊形或長梭形，有兩個(gè)或多個(gè)突起(×100)； b.特異性抗體VCAM鑒定結(jié)果為陽性(×400)

圖2RA炎性滑膜成纖維細(xì)胞

Figure 2The RA synovial fibroblasts

注：a. RA炎性滑膜成纖維細(xì)胞變圓，邊緣不清，突起不明顯，胞內(nèi)現(xiàn)顆粒狀及空泡狀物質(zhì)(×200)； b.特異性抗體BMPR鑒定結(jié)果為陽性 (×400)

2.3不同灸法艾灸血清培養(yǎng)RA滑膜成纖維細(xì)胞48h后的細(xì)胞形態(tài)用不同灸法艾灸血清培養(yǎng)RA滑膜成纖維細(xì)胞48h后，與對照組相比，各艾灸組細(xì)胞變?yōu)樗笮?，?xì)胞變得光滑飽滿，細(xì)胞之間通過突起連接更加緊密，細(xì)胞中空泡狀及顆粒狀物質(zhì)減少，其中以隔姜灸組最為顯著(圖3a～d)。

圖3不同灸法艾灸血清培養(yǎng)RA滑膜成纖維細(xì)胞48h后的細(xì)胞形態(tài)

Figure 3The morphological of RA synovial fibroblasts after culturing with different moxibustional serum for 48h

注：a.對照組，b.直接灸組，d.溫和灸組, d.隔姜灸組；與對照組相比，各艾灸組細(xì)胞變得光滑飽滿，細(xì)胞中空泡狀及顆粒狀物質(zhì)減少，其中隔姜灸組最為顯著。

3討論

成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLC)是炎性滑膜炎中組織損傷和基質(zhì)重塑的直接效應(yīng)細(xì)胞，在RA發(fā)病機(jī)制中起著重要作用?；こ衫w維細(xì)胞能通過分泌金屬蛋白酶等途徑介導(dǎo)關(guān)節(jié)破壞，同時(shí)通過刺激破骨細(xì)胞的生成來促進(jìn)骨的吸收，再者，它們還能通過釋放表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等刺激血管生成，通過釋放趨化因子招募白細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)，從而誘導(dǎo)滑膜炎癥[4-5]。針對RA滑膜炎癥的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，高駿等[6-8]證明，艾灸治療能抑制滑膜細(xì)胞中NF-κB、MAPK、JAK-STAT等炎性信號傳導(dǎo)途徑；李秀坤等[9-11]發(fā)現(xiàn)艾灸能明顯減少RA滑膜細(xì)胞對IL-1、TNF-α、PDGF(血小板衍生因子)、EGF(上皮生長因子)、ICAM-1(細(xì)胞間粘附分子)等炎癥相關(guān)因子的分泌，楊涵棋等研究報(bào)道[12-13]，直接灸、溫和灸、隔姜灸三種不同灸法均能明顯降低RA模型動物關(guān)節(jié)滑膜液中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1的含量，其中隔姜灸最為顯著。

近年來“針灸血清”研究方法的提出[14],為直接觀察針灸對細(xì)胞、離體組織等的影響提供了重要的思路和方法。所謂“針灸血清”是指艾灸或針刺治療后的人或動物血清，將此作為效應(yīng)物質(zhì)加入到另一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中，此系統(tǒng)可以是離體器官、組織、細(xì)胞或分子等，通過觀察反應(yīng)前后其功能或形態(tài)改變，直接反應(yīng)針灸處理后產(chǎn)生的效應(yīng)[15]。本文中，我們用不同艾灸方法治療組大鼠血清作用于體外培養(yǎng)的RA滑膜成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用三種不同灸法的艾灸血清培養(yǎng)RA炎性滑膜成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞由圓形、不規(guī)則形的炎性細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形的正?；こ衫w維樣細(xì)胞形態(tài)，其中隔姜灸組最為明顯?？赡苁前闹委熀笠鹧逯心承┗钚晕镔|(zhì)含量有意義的改變，從而能有效減輕RA模型動物滑膜炎性反應(yīng)，使RA炎性滑膜成纖維細(xì)胞逐漸向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

4結(jié)論

本研究用直接灸、溫和灸、隔姜灸三種不同灸法刺激實(shí)驗(yàn)性RA大鼠“腎俞”、“足三里”穴，收集各艾灸治療組血清培養(yǎng)炎性滑膜成纖維細(xì)胞。結(jié)果顯示，經(jīng)不同灸法艾灸血清作用48h后，大鼠RA滑膜成纖維細(xì)胞形態(tài)得到改善，由圓形、不規(guī)則形的炎性細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形的正常滑膜成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，以隔姜灸法治療效果最為明顯。本研究結(jié)果提示艾灸治療可改善病理性炎性滑膜成纖維細(xì)胞生長狀態(tài)，并具有促進(jìn)其向正?；D(zhuǎn)歸的作用。

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