■崔艷紅 韓慶功 王元元 張 月 劉興友 劉長忠

（河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，帶動了我國國民經(jīng)濟的發(fā)展，使得人民的生活水平有所提高。然而，隨著國民生活水平的不斷提高和日益改善，對畜禽肉、奶、蛋品質(zhì)的要求也逐漸越來越高，這就要求在集約化養(yǎng)殖中生產(chǎn)出健康的、無害的產(chǎn)品[1]。飼料是影響生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)畜產(chǎn)品的重要因素，由于環(huán)境資源日益惡化，優(yōu)質(zhì)飼料資源的嚴重短缺，利用微生物發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)高質(zhì)、無污染的飼料是未來發(fā)展的趨勢，因微生物發(fā)酵可以產(chǎn)生多種酶類，發(fā)酵過程中還能夠生成大量的菌體蛋白以及一些促進動物腸道內(nèi)有益菌群生長的生物活性物質(zhì)，對提高飼料利用率，提升飼料品質(zhì)，從而改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)、減少畜產(chǎn)品中藥物殘留具有顯著的作用[2]。近年來，隨著多國限制或禁止使用抗生素，益生菌發(fā)酵飼料已成為一種新型綠色飼料，微生物發(fā)酵飼料的迅速發(fā)展，為畜禽養(yǎng)殖提供了一條無害、無污染的新選擇。發(fā)酵飼料是利用有益微生物通過自身的代謝活動將飼料中的大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)或?qū)⑵淇範I養(yǎng)因子分解或轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生易被畜禽消化、吸收利用的飼料[3]。

單一菌種的微生物發(fā)酵模式逐漸被多菌種復(fù)合協(xié)同發(fā)酵所取代，混合菌共發(fā)酵需要考慮微生物之間的共生關(guān)系，應(yīng)使其充分發(fā)揮協(xié)同和互補作用[4]。本試驗采用3種菌對斷奶仔豬濃縮飼料進行厭氧發(fā)酵處理，分別是對畜禽有益的畢赤酵母、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌。通過對發(fā)酵后濃縮料的營養(yǎng)特性分析，可探討微生物發(fā)酵前后濃縮料營養(yǎng)成分的變化，以期獲得一種更優(yōu)質(zhì)的飼料，降低養(yǎng)殖成本，增加經(jīng)濟效益，同時為發(fā)酵濃縮飼料在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

畢赤酵母、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌，由河南省生豬工程中心實驗室分離保存提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

① MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、Tween-80 1.0 ml、牛肉提取物10.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸鈉 5.0 g、酵母提取物 5.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、K2HPO42.0 g，配成 1 000 ml的溶液，用NaOH調(diào)pH值為6.5，121℃，滅菌20 min。

② 孟加拉紅培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 ml、瓊脂20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀0.5 g、1/3 000孟加拉紅100 ml、葡萄糖10 g、氯霉素0.1 g，121 ℃，滅菌20 min。

③ LB培養(yǎng)基：氯化鈉10.0 g、酵母膏5.0 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖20 g、水1 000 ml，121 ℃，滅菌20 min。

1.1.3 斷奶仔豬濃縮飼料

參照NRC營養(yǎng)標準(1998)斷奶仔豬營養(yǎng)需要量，配制濃縮飼料，飼料中不含抗生素。試驗日糧配方組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.1.4 儀器與設(shè)備

雷磁pH復(fù)合電極（江蘇儀電科學(xué)儀器公司）、85-2恒溫磁力攪拌器（江蘇中大儀器廠）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（G2X-9076 MBE上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠）、高壓滅菌箱（河南省三強醫(yī)療器械有限公司）、分析電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（hpx-9272 MBE上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠）、潔凈工作臺（江蘇凈化設(shè)備公司）、凱氏定氮裝置。

表1 試驗日糧配方和營養(yǎng)水平

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備

用接種環(huán)分別挑取三種菌菌落，劃線接種于斜面固體培養(yǎng)基上，將接種好的菌種置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后再挑取活化好的菌種，分別接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，放置培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃下培養(yǎng)16 h。

1.2.2 正交試驗設(shè)計

混合菌共發(fā)酵斷奶仔豬濃縮料條件優(yōu)化試驗設(shè)計（3菌種比例設(shè)計為植物乳桿菌∶枯草芽孢桿菌∶畢赤酵母）

表2 正交L16（44）因素及水平設(shè)計

稱取濃縮料50 g于三角瓶中，每個處理3個重復(fù)，采用4因素4水平正交試驗設(shè)計，研究接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、菌種比例對發(fā)酵濃縮料的影響(見表2)，以pH值、乳酸和酸性蛋白含量為衡量指標，綜合評定確定混合菌發(fā)酵的最佳條件。

1.2.3 試驗指標的測定

1.2.3.1 pH值的測定

用電子天平稱取發(fā)酵后的飼料5 g，放入50 ml的燒杯中，再加入10 ml的蒸餾水；將燒杯放在磁力攪拌器上攪拌1 min，然后靜置10 min，用pH復(fù)合電極測定溶液的pH值，并記錄結(jié)果。

1.2.3.2 乳酸含量的測定

發(fā)酵后濃縮料樣品用電子天平稱取15 g，倒入150 ml的燒杯中，用量筒量取100 ml蒸餾水加入燒杯中；將燒杯放在磁力攪拌器上攪拌30 min，靜置10 min；取上清液15 ml于三角瓶中，再加入30 ml蒸餾水稀釋，然后加入酚酞指示劑四滴；用NaOH標準溶液滴定，溶液呈粉紅色時為止，并記錄NaOH標準溶液的消耗量。

1.2.3.3 酸性蛋白的測定

①用電子分析天平稱取樣品1.000 g，加入15%三氯乙酸溶液溶解，定容至50 ml，混勻后靜置5 min，過濾后除了初濾液，其余作為備用液。

②用移液管吸取10～25 ml濾液于干燥的定氮瓶（100 ml或500 ml）中，加入0.2 g硫酸銅、6 g硫酸鉀及20 ml硫酸，與試樣混合均勻，再加濃硫酸10 ml和2粒玻璃珠。將凱氏燒瓶放在電爐上加熱，直至溶液呈藍綠色。同時做試劑空白試驗。

③裝好蒸餾裝置。

④ 向接受瓶內(nèi)加入10 ml硼酸溶液（20 g/l）及1～2滴混合指示劑，讓冷凝管的下端插入液面以下，準確移取10 ml試樣處理液由小漏斗流入反應(yīng)室，用10 ml水洗滌小燒杯使其流入反應(yīng)室，立即將玻璃塞蓋緊，并加水于小玻璃杯以防漏氣。蒸餾5 min后移動接收瓶，使液面離開冷凝管下端，再蒸餾1 min。然后用少量蒸餾水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，滴加指示劑，用鹽酸標準溶液（0.05 mol/l）滴定，呈現(xiàn)灰色或藍紫色為止。同時吸取10 ml試劑空白消化液，按同樣步驟操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對斷奶仔豬濃縮料pH值的影響

從表3可看出，不同水平4次平均值分析結(jié)果顯示，影響最大的因素是發(fā)酵時間，其次是接種量，菌種比例對發(fā)酵后飼料pH值的影響最小。通過混合菌共發(fā)酵，飼料pH值有明顯的降低。表中A因素水平4，B因素水平1，C因素水平1，D因素水平4時發(fā)酵飼料的pH值最低，并且在A因素水平4時即接種量水平10%時pH值最低，降至5.107。因此根據(jù)發(fā)酵后飼料pH值的變化，最優(yōu)發(fā)酵條件確定為A4B1C1D4，即接種量為10%、發(fā)酵時間為36 h、溫度為25℃、菌種比例1∶1∶2。

2.2 發(fā)酵對斷奶仔豬濃縮料中乳酸含量的影響

從表4可以看出來，接種量對乳酸含量的變化影響最顯著，其次是發(fā)酵溫度。通過混合菌共發(fā)酵，飼料中乳酸含量明顯提高。同時可以看出，乳酸含量的變化和表3 pH值的高低呈對應(yīng)關(guān)系，因此實際生產(chǎn)中，可以通過pH值的變化初步判斷乳酸含量的高低。根據(jù)發(fā)酵后飼料乳酸的變化，優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：接種量為10%、發(fā)酵時間為60 h、溫度為25℃、菌種比例為1∶1∶2。

表3 發(fā)酵后濃縮料樣品pH值的變化

表4 發(fā)酵后濃縮料樣品乳酸含量的變化

2.3 發(fā)酵對斷奶仔豬濃縮料中酸性蛋白含量的影響

表5 發(fā)酵后濃縮料樣品酸性蛋白含量的變化

從表5可以看出，蛋白質(zhì)降解成易消化利用的酸性蛋白的最大影響因素是菌種比例，其次是接種量，菌種比例對酸性蛋白含量的影響最大的是2∶1∶1，發(fā)酵時間對其影響最小。表中A因素水平2，B因素水平3，C因素水平2，D因素水平2發(fā)酵后濃縮料中的酸性蛋白含量最高。根據(jù)酸性蛋白含量變化，優(yōu)化發(fā)酵條件為A2B3C2D2，即接種量為2%、發(fā)酵時間為60 h、溫度為29℃、菌種比例2∶1∶1。

2.4 優(yōu)化濃縮飼料發(fā)酵條件后營養(yǎng)特性的變化

通過綜合考慮發(fā)酵后pH值、乳酸含量和酸性蛋白含量的變化，確定濃縮飼料的優(yōu)化發(fā)酵條件為接種量為10%、發(fā)酵時間為60 h、發(fā)酵溫度為25℃、菌種比例1∶1∶2。在此條件下進行發(fā)酵前后的比較。

表6 發(fā)酵前后濃縮飼料pH值、乳酸和酸性蛋白含量比較

從表6可以看出，飼料在發(fā)酵前后pH值，乳酸含量和酸性蛋白含量都發(fā)生了變化。飼料發(fā)酵后pH值由原來的6.5降低到5.10，發(fā)酵后pH值降低21.54%。乳酸含量由飼料發(fā)酵前的0.38%提高到發(fā)酵后的0.93%，提高了144.74%。酸性蛋白含量在飼料發(fā)酵前為8.55%提高到發(fā)酵后的10.74%，提高了25.61%。

3 討論

3.1 乳酸變化的影響因素

發(fā)酵時間的長短是發(fā)酵產(chǎn)酸的重要條件之一，發(fā)酵時間太短，則合成產(chǎn)物濃度不夠，發(fā)酵的不夠徹底，發(fā)酵時間太長，會導(dǎo)致菌體死亡，生成一些不需要的副產(chǎn)物，同時也會造成物料的耗費，增大生產(chǎn)成本。因此，需要確定一個合適的發(fā)酵時間。本試驗結(jié)果表明，發(fā)酵時間為60 h時，發(fā)酵時所產(chǎn)乳酸量最高。首先，早期階段的發(fā)酵基質(zhì)營養(yǎng)豐富，營養(yǎng)物質(zhì)可以吸收細菌繁殖，酵母和枯草芽孢桿菌在有氧階段快速消耗氧氣[5]，在厭氧階段植物乳酸菌繁殖產(chǎn)生高乳酸;其次，隨著微生物的生長也會消耗部分營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生二氧化碳和水，產(chǎn)酸能力逐漸下降[1]。

溫度直接影響著生物生長，同時也影響機體產(chǎn)酸，本試驗中混菌發(fā)酵的溫度為25℃。丁子健[6]利用芽孢乳桿菌對葡萄糖進行發(fā)酵來制備乳酸，結(jié)果表明在最佳發(fā)酵溫度37℃條件下，發(fā)酵所產(chǎn)乳酸量達到最大值，為33.3 g/l，二者在溫度和產(chǎn)酸量上存在差異。

pH值也是影響微生物生長代謝的一個重要因素，不同的微生物所適應(yīng)的范圍不一樣。本試驗結(jié)果表明，斷奶仔豬濃縮飼料經(jīng)三種菌混合發(fā)酵后pH值由6.5降低到5.10，所以在pH值為5.10的條件下發(fā)酵產(chǎn)酸最好。原因可能是飼料中存在雜菌，因為微生物與接種菌種之間互相排斥，需在偏酸性的環(huán)境中才可抑制雜菌的生長，所以pH值為5.10時有益于發(fā)酵菌的生長，同時抑制了雜菌的繁殖[7]。

3.2 發(fā)酵飼料對消化吸收的影響

雖然豆粕的營養(yǎng)非常豐富，但是由于大豆中含有諸多的抗營養(yǎng)因子，這些抗營養(yǎng)因子能夠影響動物對養(yǎng)分消化、吸收[8]，大大降低了豆粕的利用效率[9]，因此在飼喂以豆粕為主要的蛋白質(zhì)原料時，要想辦法去除這些抗營養(yǎng)因子。通過微生物發(fā)酵處理，可以對蛋白質(zhì)進行降解，將蛋白質(zhì)降解為易吸收的小肽，小肽含量的增加可增強機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，使之提高抵抗力。采用發(fā)酵濃縮飼料的菌種是畢赤酵母，枯草芽孢桿菌，植物乳桿菌。其中酵母菌含有極豐富的蛋白質(zhì)，粗蛋白含量可達50%，易消化，氨基酸組成平衡性好，而且含有豐富的B族維生素。同時酵母菌還含有豐富的酶系統(tǒng)。經(jīng)酵母菌發(fā)酵過的飼料具有獨特的色、香、味，可以較好地改善飼料的適口性。并能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進行發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等有機酸[10]。乳酸具有調(diào)節(jié)pH值、抑菌、延長保質(zhì)期等優(yōu)點[11-13]。微生物發(fā)酵的飼料可以減少飼料轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本，改善適口性，符合新型綠色飼料的發(fā)展趨勢。

3.3 發(fā)酵飼料對動物生產(chǎn)性能的影響

因益生菌發(fā)酵飼料后具有改善飼料的適口性，提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)消化率及利用率的功能，還可以降解飼料中的抗營養(yǎng)因子和有毒物質(zhì)，同時具有抑制消化道中有害菌的繁殖與生長的作用，因此成為研究和開發(fā)的熱點，發(fā)酵飼料在養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用研究報道也越來越多。趙正興[14]的研究表明，在育肥豬日糧中添加10%、20%的有益微生物(EM)發(fā)酵飼料具有明顯的促生長作用，試驗組比對照組的日增重由14.38%提高到24.04%，飼料報酬也有所提高，每1 kg增重所需要的飼糧減少了11.36%和15.91%。王樹香等[15]報道，用發(fā)酵秸稈粉替代5%的全價飼料飼喂肉雞，與對照組相比，肉仔雞日增重提高了15.79%，料重比降低了13.78%，各項血液生化指標均差異不顯著(P＞0.05)。說明飼料中添加不同比例的發(fā)酵秸稈飼料對肉仔雞生長性能沒有影響，但可以節(jié)約成本。梅寧安[16]報道，飼喂含10%發(fā)酵馬鈴薯渣的肉仔雞配合飼料，對照組飼喂含5%棉粕和5%菜粕的肉仔雞配合飼料，研究結(jié)果表明，與對照組相比，試驗組肉仔雞日增重提高3.29%(P＞0.05)，料重比降低5.58%(P＜0.05)，試驗組肉仔雞膚色較黃，肌肉pH值、肌肉組織彈性、肌肉氣味、器官濕重、清烹肉湯鑒定指標、品嘗評價均無異常。王俊等[17]的研究表明，乳酸菌發(fā)酵飼料能明顯降低料肉比，增加平均日增重（日增重最高達到48 g），并且2條生產(chǎn)線豬舍氨含量平均分別降低了約38%和50%，尿中總氮和氨氮平均約降低25%左右。開發(fā)微生物發(fā)酵飼料，可以緩解我國飼料資源緊張，保障飼料安全，減少環(huán)境污染，降低養(yǎng)殖業(yè)的飼料成本，而且可以減少甚至消除抗生素和其他藥物的使用，發(fā)展健康生態(tài)養(yǎng)殖具有至關(guān)重要的意義。

4 小結(jié)

通過微生物發(fā)酵處理，篩選出發(fā)酵濃縮料的最優(yōu)條件為:接種量10%、發(fā)酵時間60 h、發(fā)酵溫度25℃、菌種比例1∶1∶2。發(fā)酵濃縮飼料經(jīng)畢赤酵母、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌3種菌混合發(fā)酵后，pH值降低22%，乳酸含量提高了144.74%，酸性蛋白含量在飼料發(fā)酵前為8.55%，發(fā)酵后達到了10.74%，提高了25.61%。