石麗娟 孫 潔 金鐵峰

(延邊大學(xué)病理學(xué)教研室 吉林 延吉 133002)

肺癌是臨床上的常見病，其發(fā)病率及致死率均高居惡性腫瘤的首位。肺癌患者在發(fā)病早期其臨床癥狀較不典型，其病情在得到確診時(shí)往往已經(jīng)進(jìn)入晚期，其生存率較低。肺癌患者體內(nèi)的腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是導(dǎo)致其預(yù)后極差最主要的原因。近年來的研究表明，miRNA-200可調(diào)控L1CAM的表達(dá)，促使肺癌細(xì)胞與血管壁粘附，進(jìn)而可促使其發(fā)生轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miRNA-200在人肺癌細(xì)胞系中表達(dá)的情況，以便為臨床上治療肺癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌細(xì)胞株 H1792、HCC2279、PC9、H1299、CALU-1、H2052、PC7、H2122、H322、SQ-5、A549、EBC-1、H157、 H1650均購(gòu)自ATCC公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司。胰蛋白酶購(gòu)自Santa Cruz 公司。

1.2 方法 對(duì)H1792等肺癌細(xì)胞株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)的方法是：將H1792等肺癌細(xì)胞株置于含10%胎牛血清、1%雙抗的1640培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。將肺癌細(xì)胞用PBS進(jìn)行清洗，用Triozol進(jìn)行充分裂解，在其中加入氯仿進(jìn)行震蕩，加入異丙醇進(jìn)行靜置，然后進(jìn)行PCR處理，相關(guān)的溫度條件為：變性溫度為95℃、退火溫度為58℃、延伸溫度為72℃。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳操作，并將其置于凝膠成像儀中分析檢測(cè)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，在進(jìn)行兩組均數(shù)間的比較時(shí)采用 t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)miR-200在本組肺癌細(xì)胞系中表達(dá)情況的分析 在 H1792等16種肺癌細(xì)胞系中檢測(cè)miR-200的相對(duì)表達(dá)量，如圖1所示。檢測(cè)結(jié)果表明，H1792、HCC2279、PC9、H1299、CALU-1、H2052、HCC44及 H322等 肺 癌細(xì)胞系中miR-200的表達(dá)量較高，SQ-5、A549、EBC-1、H157、H358及H1650等肺癌細(xì)胞系中miR-200的表達(dá)量較低。從這些肺癌細(xì)胞系中選擇表達(dá)量最高的H1792和表達(dá)量最低的H1650兩個(gè)肺癌細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.2 對(duì)miR-200在肺癌細(xì)胞系中的高表達(dá)在促進(jìn)其遷移方面的作用分析 將miR-200呈高表達(dá)的H1792肺癌細(xì)胞系和miR-200呈低表達(dá)的H1650肺癌細(xì)胞系在6孔板上進(jìn)行培養(yǎng)后統(tǒng)一進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，在48個(gè)小時(shí)后進(jìn)行拍照分析，結(jié)果表明，與miR-200呈低表達(dá)的H1650肺癌細(xì)胞系相比，miR-200呈高表達(dá)的H1792肺癌細(xì)胞系其遷移的速度較快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。詳情見圖2。

圖1 對(duì)miR-200在本組肺癌細(xì)胞系中表達(dá)情況的分析

圖2 經(jīng)劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-200的高表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞系的遷移(* p＜0.05)

3 討論

肺癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。早期肺原位癌患者的生存率較高，但其體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移其預(yù)后可顯著變差。找出可參與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子靶點(diǎn)和信號(hào)通路是治療肺癌的關(guān)鍵。miR-200在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中可起到重要的作用，但其作用機(jī)制仍存在一定的爭(zhēng)議。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200家族（miR-200a/miR-200b/miR-200c/miR-141/miR429）在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的發(fā)生密切相關(guān)，在EMT的發(fā)生和腫瘤的進(jìn)展中可發(fā)揮重要的作用[1]。miR-200可通過與ZEB形成負(fù)反饋回路調(diào)控EMT及腫瘤細(xì)胞的活性[2,3]。P53是miR-200的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可激活miR-200[4]。

我們的研究表明，在16種肺癌細(xì)胞系中miR-200的表達(dá)量各不相同。miR-200呈高表達(dá)的細(xì)胞系其遷移能力明顯較強(qiáng)?？梢姡琺iR-200可能在肺癌發(fā)生侵襲遷移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程中起到重要的作用，其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

[1] McCaffrey LM, Macara IG: Epithelial organization, cell po larity and tumorigenesis. Trends in cell biology 2011,21(12):727-735.

[2] Brabletz T: To differentiate or not--routes towards me tastasis. Nature reviews Cancer 2012, 12(6):425-436.

[3] Korpal M, Lee ES, Hu G, Kang Y: The miR-200 family inhi bits epithelial-mesenchymal transition and cancer cell migration by direct targeting of E-cadherin transcripti onal repressors ZEB1 and ZEB2. The Journal of biological chemistry 2008, 283(22):14910- 14914.

[4] Chang CJ, Chao CH, Xia W, Yang JY, Xiong Y, Li CW, Yu WH,Rehman SK, Hsu JL, Lee HH et al: p53 regulates epithelia l-mesenchymal transition and stem cell properties throu gh modulating miRNAs. Nature cell biology 2011, 13(3):317-323.