李中娥
摘要:目的 建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定痛經(jīng)靈顆粒中丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A含量的方法,為有效控制其質(zhì)量提供可靠的方法。方法 采用Welchrom C18色譜柱,以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)為流動(dòng)相梯度洗脫,流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。結(jié)果 丹酚酸B在0.197~1.316 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 6),平均回收率為98.72%,RSD=1.49%;芍藥苷在0.158~1.051 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 8),平均回收率為99.01%,RSD=0.92%;羥基紅花黃色素A在0.053~0.353 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 4),平均回收率為98.34%,RSD=1.60%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可用于痛經(jīng)靈顆粒的質(zhì)量控制。
關(guān)鍵詞:痛經(jīng)靈顆粒;丹酚酸B;芍藥苷;羥基紅花黃色素A;高效液相色譜法
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.025
中圖分類號(hào):R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1005-5304(2016)01-0103-03
Simultaneous Determination of Three Active Ingredients in Tongjingling Granules by HPLC LI Zhong-e (Nanyang Institute for Food and Drug Control, Nanyang 473061, China)
Abstract: Objective To establish a simultaneous determination method for Salvianolic acid B, Paeoniflorin and Hydroxysafflor yellow A in Tongjingling Granules; To provide a reliable method for effective quality control. Methods The determination was performed on a Welchrom C18 column with acetonitrile (A) - 0.1% phosphoric acid (B) as the mobile phase in gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm. Results Salvianolic acid B presented in a good linear relation in the range of 0.197–1.316 μg, and the average recovery rate was 98.72% with RSD 1.49%; Paeoniflorin presented in a good linear relation in the range of 0.158–1.051 μg, and the average recovery rate was 99.01% with RSD 0.92%; Hydroxysafflor yellow A presented in a good linear relation in the concentration range of 0.053–0.353 μg, and the average recovery rate was 98.34% with RSD of 1.60%. Conclusion This method is simple, sensitive, accurate and with good reproducibility, which can be used for quality control of Tongjingling Granules.
Key words: Tongjingling Granules; Salvianolic acid B; Paeoniflorin; Hydroxysafflor yellow A; HPLC
痛經(jīng)靈顆粒收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第十五冊(cè),由丹參、赤芍、香附(醋制)、蒲黃、紅花、延胡索、烏藥等組成,具有活血化瘀、理氣止痛功效,臨床用于治療氣滯血瘀所致痛經(jīng)。該產(chǎn)品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中沒有含量測(cè)定項(xiàng)[1],無法有效控制其質(zhì)量。以往報(bào)道多以原兒茶醛或芍藥苷等單一成分作為質(zhì)控指標(biāo)[2-3],本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)[4-8],對(duì)樣品處理方法和色譜分離系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化,采用高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)對(duì)方中3味主藥的特征性活性成分丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A含量進(jìn)行測(cè)定,從而在簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟、節(jié)約檢測(cè)資源的情況下,更好地控制該藥品的質(zhì)量。
1 儀器與試藥
Agilent 1260高效液相色譜儀,配四元梯度泵、G1314F紫外檢測(cè)器;賽多利斯BP-211D電子天平;KQ-300DE型數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)。
對(duì)照品丹酚酸B(批號(hào)111562-201110,含量98.0%)、芍藥苷(批號(hào)110736-201035,含量96.5%)、羥基紅花黃色素A(批號(hào)111637-200905,含量91.8%)均購自中國食品藥品檢定研究院,乙腈(HPLC,Welch Materials Inc.),磷酸(分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠),水為重蒸餾水。痛經(jīng)靈顆粒(市售)。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱:Welchrom C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0~12 min,12%A;12~20 min,12%A→34%A;20~30 min,34%A;30~35 min,34%A→12%A);檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于4000,各峰之間分離度符合要求。
2.2 溶液的制備
2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品9.62 mg,置50 mL量瓶中,加75%甲醇適量使溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密稱取丹酚酸B對(duì)照品16.78 mg、芍藥苷對(duì)照品13.61 mg,置25 mL量瓶中,加上述羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液使溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得含丹酚酸B 0.657 8 mg/mL、芍藥苷0.525 3 mg/mL、羥基紅花黃色素A 0.176 6 mg/mL的溶液(對(duì)照品溶液①),精密量取2 mL,置20 mL量瓶中,加75%甲醇至刻度,搖勻,即得對(duì)照品溶液。
2.2.2 供試品溶液制備 取本品適量,研細(xì),精密稱取0.5 g,置具塞錐形瓶中,精密加75%甲醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲提?。?50 W,40 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,用微孔濾膜過濾,即得。
2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方制法分別制備不含丹參、赤芍和紅花的陰性對(duì)照樣品,按供試品溶液制備方法分別制成陰性對(duì)照溶液。
2.3 專屬性試驗(yàn)
吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,結(jié)果供試品色譜中,在與丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A對(duì)照品色譜相同的保留時(shí)間處有色譜峰,與其他組分能達(dá)到良好分離,分離度均>1.5,理論塔板數(shù)分別為8326、10 967、13 980。陰性對(duì)照色譜中,在與丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上無干擾峰,說明供試品溶液中的其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響,見圖1。
2.4 線性關(guān)系的考察
精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液① 0.3、0.6、0.9、1.2、1.6、2.0 mL,分別置10 mL量瓶中,加75%甲醇至刻度,搖勻,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程。丹酚酸B:Y=10.866X-1.100 9,r=0.999 6(n=6)。芍藥苷:Y=7.621X+0.292 1,r=0.999 8(n=6)。羥基紅花黃色素A:Y=11.834X-0.352 8,r=0.999 4(n=6)。結(jié)果表明,丹酚酸B在0.197~1.316 μg、芍藥苷在0.158~1.051 μg、羥基紅花黃色素A在0.053~0.353 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2.5 精密度試驗(yàn)
取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液,進(jìn)樣量10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,結(jié)果丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A的峰面積RSD分別為0.97%、1.56%、1.22%,表明精密度良好。
2.6 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批號(hào)樣品6份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定每份樣品中3種成分含量,結(jié)果丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A的含量RSD分別為1.33%、0.91%、1.52%,說明重復(fù)性良好。
2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一份供品溶液,分別在0、3、6、9、12 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積,結(jié)果丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A的峰面積RSD分別為1.59%、1.13%、1.27%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.8 加樣回收率試驗(yàn)
精密稱取已測(cè)得含量(丹酚酸B 2.628 mg/g,芍藥苷2.083 mg/g,羥基紅花黃色素A 0.706 mg/g)的痛經(jīng)靈顆粒6份,每份0.25 g,分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液①各1.0 mL,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。
2.9 樣品測(cè)定
按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件,測(cè)定來自云南、河北、陜西、吉林不同廠家共12批樣品中3種成分的含量,結(jié)果見表2。
根據(jù)12批樣品所測(cè)得的結(jié)果,可看出不同廠家不同批次所含3種成分的含量有所差異,質(zhì)量參差不齊,其中尤以羥基紅花黃色素A的含量差別為大,可能與紅花藥材較貴且在成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中較少被檢測(cè)有關(guān),因此很有必要對(duì)這3種成分合理定量,從而更好地監(jiān)管該藥品的質(zhì)量。
3 討論
本試驗(yàn)比較了30%乙醇、甲醇、50%甲醇及75%甲醇幾種溶劑的提取效果,結(jié)果以75%甲醇提取所得可更好兼顧3種成分的含量,故以75%甲醇為提取溶劑。因丹酚酸B對(duì)熱不太穩(wěn)定,故未采用回流而采用超聲方式提取,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲提取25 min后,3種成分的含量無明顯增加,所以將提取時(shí)間定在30 min。
在多成分同時(shí)檢測(cè)中,很多需要采用轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)的方式以取得好的效果[5-6]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以芍藥苷的最大吸收波長(zhǎng)230 nm作為單一檢測(cè)波長(zhǎng),其他2種成分亦吸收穩(wěn)定,響應(yīng)信號(hào)良好,線性范圍滿足需要,故采用單波長(zhǎng)檢測(cè),便于該方法更廣泛地應(yīng)用。
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(收稿日期:2014-12-02;編輯:陳靜)