許俊鋼

【摘要】 目的 應(yīng)用基因芯片對(duì)臨床常見致病細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。方法 選取4種臨床常見的致病細(xì)菌， 包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌， 應(yīng)用VereFoodborne Detection chip 芯片對(duì)所選細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 對(duì)臨床30份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)， 均得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。全部細(xì)菌檢測(cè)均在8 h內(nèi)完成， 較臨床常規(guī)檢測(cè)方法平均縮短1/3時(shí)間， 其中部分血液感染標(biāo)本檢測(cè)時(shí)間更是從原來(lái)的3～5 d縮短至1 d完成， 檢測(cè)效率大大提高。結(jié)論 基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)能準(zhǔn)確、快速地對(duì)目的細(xì)菌做出檢測(cè)， 是細(xì)菌快速檢測(cè)的發(fā)展方向。

【關(guān)鍵詞】 基因芯片；致病菌；檢測(cè)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.01.020

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌是臨床常見的致病菌。針對(duì)臨床常見的細(xì)菌感染， 目前臨床多采用常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展， PCR、熒光定量PCR等方法紛紛引入臨床微生物檢驗(yàn)中[1]， 不同于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法， 分子診斷技術(shù)在保證準(zhǔn)確性的同時(shí)， 有較強(qiáng)的特異性， 能夠更快速地提供檢測(cè)結(jié)果。本研究應(yīng)用成熟的基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)， 為基因芯片在臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌為鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室培養(yǎng)法確定菌株（共30份）。其中血液標(biāo)本16份， 痰標(biāo)本6份， 糞便標(biāo)本8份， 提取細(xì)菌DNA后應(yīng)用VereFoodborne Detection chip 芯片進(jìn)行檢驗(yàn)。

1. 2 糞便細(xì)菌DNA的抽提 采用DNA提取試劑盒“QIAamp DNA Mini Kit”， 嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作提取細(xì)菌DNA。

1. 3 細(xì)菌DNA的提取與PCR擴(kuò)增 選擇煮沸法提取細(xì)菌DNA， 大致方法是取1 ml無(wú)菌生理鹽水落于1～2個(gè)血瓊脂平板上過(guò)夜培養(yǎng)， 溫度設(shè)置為37℃， 連續(xù)培養(yǎng)12 h， 加入50 μl DNA裂解液高溫煮沸10～15 min， 然后離心（12000 rpm）5 min， 抽取長(zhǎng)清液冷藏于-20℃下。對(duì)提取的細(xì)菌DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增體系為50 μl， 94℃初變性30 s， 52℃退火45 s， 72℃延伸60 s， 95℃10 min。前后共35個(gè)循環(huán)， 72℃延伸8 min。

1. 4 探針的設(shè)計(jì) 本研究涉及的全部菌株均進(jìn)行測(cè)序?qū)Ρ闰?yàn)證。參考有關(guān)研究， 基于革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌的通用檢測(cè)探針， 將標(biāo)記為Cy3的20 T探針作為陽(yáng)性探針， 稀釋液作為陰性對(duì)照點(diǎn)布于芯片周圍。

1. 5 芯片制備 探針取上海生工生物技術(shù)有限公司， 采用Arrayit-SpotBot 3點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣， 每個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)平行點(diǎn)樣3次， 點(diǎn)完后室溫避光放置12 h（或置60℃烤箱中固定2 h）， 并固定于NC膜上。

1. 6 細(xì)菌DNA的芯片檢測(cè) 細(xì)菌DNA抽提后應(yīng)用意法半導(dǎo)體公司Veredus 快速偵檢系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

對(duì)30份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)， 其結(jié)果與目標(biāo)細(xì)菌一致。全部細(xì)菌檢測(cè)均在8 h內(nèi)完成， 較臨床常規(guī)檢測(cè)方法平均縮短1/3時(shí)間， 其中部分血液感染標(biāo)本檢測(cè)時(shí)間更是從原來(lái)的3～5 d縮短至1 d完成， 檢測(cè)效率大大提高， 這有助于為及時(shí)搶救、治療贏得時(shí)間。

3 討論

基因芯片（gene chip）又稱DNA微陣列（microarray）， 是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列， 其基本原理是通過(guò)雜交檢測(cè)信息。基因芯片是分子生物學(xué)和微電子學(xué)及信息學(xué)相互結(jié)合所形成的新型技術(shù)， 利用基因芯片， 可以實(shí)現(xiàn)基因信息的大規(guī)模檢測(cè)[2-4]?；蛐酒夹g(shù)是以基因序列為分析對(duì)象的生物芯片， 是技術(shù)最成熟， 且已實(shí)現(xiàn)商用的芯片檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)的核心是集成處理， 即將探針集成于同一基片上， 通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)以實(shí)現(xiàn)對(duì)巨量基因信息的檢測(cè)分析， 而其具體工作原理是通過(guò)在載體上按特定布陣固定分子探針， 以PCR和分子雜交為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的快速、有效地檢測(cè)， 這樣不僅顯著提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性， 還大大提高了檢測(cè)效率， 尤其是在感染性疾病的高發(fā)以及復(fù)雜性加劇的背景下， 微生物快速檢測(cè)的強(qiáng)度和難度也越來(lái)越大， 單單依賴于細(xì)菌分離培養(yǎng)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足臨床的需求， 而基因芯片技術(shù)具有的檢測(cè)高效、范圍廣等優(yōu)點(diǎn)， 使其在病原菌快速檢測(cè)領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越突出， 隨之在基因序列分析、抗感染藥物研制等上下關(guān)聯(lián)領(lǐng)域也有著越發(fā)廣闊的應(yīng)用前景[5]。

本研究結(jié)果顯示， 全部細(xì)菌檢測(cè)均在8 h內(nèi)完成， 較臨床常規(guī)檢測(cè)方法平均縮短1/3時(shí)間， 其中部分血液感染標(biāo)本檢測(cè)時(shí)間更是從原來(lái)的3～5 d縮短至1 d完成， 檢測(cè)效率大大提高， 這有助于為及時(shí)搶救、治療贏得時(shí)間。

基因芯片技術(shù)經(jīng)過(guò)20年的發(fā)展已經(jīng)形成了一個(gè)系統(tǒng)的平臺(tái)， 從樣品制備、芯片制作、芯片雜交、數(shù)據(jù)掃描到后期的數(shù)據(jù)管理、儲(chǔ)存以及深度數(shù)據(jù)挖掘都有了標(biāo)準(zhǔn)化的流程。目前商業(yè)化的基因芯片， 芯片設(shè)計(jì)上探針與待檢測(cè)的目標(biāo)序列片段互補(bǔ)， 具有完全的互補(bǔ)性；從而既有較高的敏感性， 也有較高的特異性， 僅對(duì)特定目標(biāo)序列片段敏感， 對(duì)其他序列不產(chǎn)生雜交信號(hào)， 通過(guò)探針設(shè)計(jì)， 提高基因芯片檢測(cè)的容錯(cuò)性、可靠性， 在基因芯片上設(shè)置質(zhì)量監(jiān)控探針， 以便于監(jiān)控基因芯片產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性；通過(guò)探針布局， 使得最終的雜交檢測(cè)圖像便于觀察理解[6]， 質(zhì)量穩(wěn)定性好， 可重復(fù)性強(qiáng)。

從本研究結(jié)果來(lái)看， 基于基因芯片技術(shù)的快速檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果與目標(biāo)細(xì)菌一致， 說(shuō)明檢測(cè)準(zhǔn)確率令人滿意。實(shí)際上， 隨著基因芯片技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展， 諸如玻璃芯片、液相芯片、模芯片等模式正在大大豐富基因芯片在細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用范圍。不過(guò)， 基因芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌也存在一定的局限， 如無(wú)法精確地提供涉及細(xì)菌毒力、耐藥等信息， 且受細(xì)菌雜交影響大。不過(guò)， 隨著分子生物學(xué)、半導(dǎo)體微電子技術(shù)等基因技術(shù)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展， 更為綜合性和標(biāo)準(zhǔn)化的基因芯片技術(shù)開始出現(xiàn)， 如利用多重PCR與芯片技術(shù)相結(jié)合的DNA芯片， 可同時(shí)檢測(cè)8種生物恐怖相關(guān)的病原菌， 且精確率高， 大大提高了檢測(cè)效率。此外， 本研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)基因芯片在檢測(cè)掃描結(jié)束后， 其呈現(xiàn)的熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)一定的衰減， 而背景信號(hào)強(qiáng)度則逐漸增強(qiáng)。不過(guò)， 時(shí)間延長(zhǎng)至60 d觀察， 信號(hào)強(qiáng)度受SNR值影響微小， 判斷結(jié)果基本不受干擾， 從這個(gè)角度上說(shuō)， 檢測(cè)完畢后芯片可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的留存， 便于復(fù)檢。不過(guò)， 許多新的技術(shù)仍處于試驗(yàn)階段， 相信未來(lái)隨著基因芯片技術(shù)的進(jìn)一步成熟， 其應(yīng)用范圍將擴(kuò)展到微生物診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物危害防治等領(lǐng)域， 大大拓寬基因芯片技術(shù)的邊界。

參考文獻(xiàn)

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[收稿日期：2015-07-10]