張在其 幸小亮 賀凱 黃雪霜 楊勇 張荔銘

心博驟停(cardiac arrest，CA)引起嚴(yán)重的全身性組織缺氧缺血，心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation, CPR)可使機(jī)體恢復(fù)自主循環(huán)，但也會造成不可逆全身性缺血/再灌注損傷[1-3]。以往研究發(fā)現(xiàn)，過多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)對心肌細(xì)胞有顯著損害作用[4-6]。因此，如何降低缺血/再灌注損傷時大量ROS的產(chǎn)生成為臨床上的研究重點(diǎn)。誘導(dǎo)內(nèi)源性一氧化碳產(chǎn)生可有效保護(hù)復(fù)蘇后心功能和缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞[7-9]，但其是否通過降低ROS而起作用未見報道。本研究采用一氧化碳釋放分子3(CO-releasing molecules, CORM-3)干預(yù)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞，通過觀察CORM-3的不同濃度及不同干預(yù)時間對心肌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響，探討CORM-3保護(hù)作用的濃度和時間效應(yīng)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌細(xì)胞H9c2株購于武漢博士德生物工程有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)所需要的高糖DMEM、無糖DMEM、胎牛血清、胰酶均購于GIBICO公司，CORM-3購于Sigma公司，ROS檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)儀器及耗材均由湖南醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.大鼠心肌細(xì)胞H9c2的培養(yǎng)及缺氧/復(fù)氧處理：根據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行大鼠心肌細(xì)胞H9c2的缺氧處理[10-12]。將大鼠心肌細(xì)胞H9c2置于含100 g/L胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度90%左右時用2.5 g/L胰酶消化轉(zhuǎn)至24孔板進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)分為對照組、缺氧6 h組和缺氧10 h 組。對照培養(yǎng)和復(fù)氧培養(yǎng)均采用100 g/L FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，放入5%CO2、95%空氣、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；缺氧培養(yǎng)采用無FBS的DMEM無糖培養(yǎng)基，置于5%CO2、95%N2、37℃缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測心肌細(xì)胞內(nèi)ROS量。

2.CORM-3溶液配制及干預(yù)分組：10 mg CORM-3粉末溶于3.4 mL無菌水中溶解后配成10 mmol/L的濃儲液，分裝至PCR管中-20℃保存，使用時再進(jìn)行稀釋。將CORM-3溶解在PBS(pH值7.40)中稀釋并室溫靜止2 d，使用前用N2鼓泡10 min去除液體中殘余的CO，制備成含CO活性的CORM溶液。為探討不同濃度CORM-3對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，將H9c2心肌細(xì)胞缺氧6 h后，分別采用10 μM、50 μM、100 μM和200 μM 的CORM-3復(fù)氧6 h進(jìn)行心肌細(xì)胞內(nèi)ROS檢測；為探討不同復(fù)氧時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，選用50 μM CORM-3對缺氧6 h的心肌細(xì)胞分別進(jìn)行2 h、4 h、6 h、10 h復(fù)氧后檢測心肌細(xì)胞內(nèi)ROS量。

3.心肌細(xì)胞內(nèi)ROS檢測：各組心肌細(xì)胞按照1∶10 00的比例加入10 mM的2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)使其終濃度為10 μM，在37℃培養(yǎng)箱中放置20 min后用PBS洗滌細(xì)胞3次，再用0.25%胰酶消化后重懸于100 μL PBS中，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至黑色平底96孔板中置于多功能酶標(biāo)儀中測量495 nm/525 nm波長下的熒光值。熒光值與對照組相比進(jìn)行歸一化處理，計算相對吸光度(A)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、不同缺氧時間對心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

與對照組相比，缺氧6 h組的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS量升高極顯著(P<0.0001)；缺氧10 h組的心肌細(xì)胞死亡過多，未進(jìn)行ROS檢測見圖1。

注：aP<0.000 1

圖1缺氧6 h對心肌細(xì)胞內(nèi)ROS量的影響

二、不同濃度CORM-3對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

與對照組相比，10 μmol/L CORM-3組的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS量有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；50 μmol/L、100 μmol/L CORM-3組的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS量均顯著降低P<0.05；200 μmol/L CORM-3組的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS量有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，然而與50 μmol/L、100 μmol/L組相比時，心肌細(xì)胞內(nèi)ROS量均顯著升高(P<0.05)。見圖2。

三、不同復(fù)氧時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

與對照組相比，復(fù)氧2 h、4 h組細(xì)胞內(nèi)ROS量有所降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)氧6 h、10 h組細(xì)胞內(nèi)ROS量均顯著降低(P<0.05)。與復(fù)氧2 h、4 h組相比，復(fù)氧6 h組細(xì)胞內(nèi)ROS量均顯著降低(P<0.05)。與復(fù)氧6 h組相比，復(fù)氧10 h組細(xì)胞內(nèi)ROS量有輕微的升高(P>0.05)。見圖3。

注：分別為CORM-3 10 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，與對照組比較aP<0.05；CORM-3 200 μmol/L與對照組比較，bP<0.05；分別為CORM-3 50 μmol/L，100 μmol/L，與200 μmol/L比較cP<0.05

圖2不同濃度CORM-3對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

注：復(fù)氧2 h組，4 h組與對照組相比，aP>0.05；復(fù)氧6 h組，10 h 組與對照組相比bP<0.05；復(fù)氧2 h組，4 h組與復(fù)氧6 h組相比cP<0.05；復(fù)氧10 h組與復(fù)氧6 h組相比，dP<0.05

圖3不同復(fù)氧時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

討 論

心肺復(fù)蘇是搶救心臟驟?；颊叩闹饕胧?，但同時也會造成不可逆缺血/再灌注損傷[1-3]，復(fù)蘇后心功能不全是復(fù)蘇早期高死亡率的重要原因。目前，關(guān)于缺血/再灌注損傷存在多種學(xué)說進(jìn)行，其中之一就是ROS損傷學(xué)說，主要原因?yàn)槿毖踉缙谝鸫罅縍OS的產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致CPR后組織細(xì)胞損傷，因此，有研究者認(rèn)為改善氧化應(yīng)激反應(yīng)對于減少心臟驟停的損傷具有重要作用[13-15]。ROS是細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基和能轉(zhuǎn)化為氧自由基的物質(zhì)，其中內(nèi)源性ROS主要來自線粒體的有氧呼吸與代謝，為呼吸鏈的主要產(chǎn)物源。ROS是機(jī)體內(nèi)不可或缺的物質(zhì)，一定濃度的ROS對機(jī)體起著重要的生理作用[16]，當(dāng)濃度較高時，反而會對機(jī)體產(chǎn)生損傷[17-18]。Hao等[19]認(rèn)為高濃度的ROS不宜外周造血干細(xì)胞特性的維持。Zhang等[20]認(rèn)為，ROS在胰腺癌中起“雙刃劍”的作用，高濃度ROS顯著損傷癌細(xì)胞并導(dǎo)致其死亡，Yang等[21]認(rèn)為，癌細(xì)胞內(nèi)ROS量較正常細(xì)胞明顯增多，因此成為選擇性治療癌癥新的研究靶點(diǎn)。降低缺氧細(xì)胞內(nèi)ROS量的產(chǎn)生對維持機(jī)體正常功能具有重要意義。

CORM-3為水溶性CO釋放分子[22-23]，Pizarro等[24]研究發(fā)現(xiàn)，使用CORM-3能減輕捐贈者肝臟冷凍保存和轉(zhuǎn)移中的損傷，研究者認(rèn)為該輔助保護(hù)方法同樣適用于心臟、腎臟等氣管的保存和轉(zhuǎn)運(yùn)。Kim等[25]研究發(fā)現(xiàn)，CORM-3聯(lián)合NO能反向誘導(dǎo)肝線粒體生成，成為治療線粒體疾病的一項(xiàng)重要策略。Long等[23]研究發(fā)現(xiàn)，CORM-3能通過磷酸鹽運(yùn)輸解偶聯(lián)線粒體的呼吸作用。Bergstraesser 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，CORM-3能抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)，該抑制作用也是通過線粒體呼吸作用及抑制p38實(shí)現(xiàn)的。因此，鑒于CORM-3在線粒體呼吸中的作用及對肝、心、腎等器官的保護(hù)作用，筆者推測CORM-3可能通過降低細(xì)胞ROS量減小再灌注損傷作用。為此，筆者首先探討不同缺氧時間對心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧6 h心肌細(xì)胞內(nèi)ROS顯著升高，缺氧10 h心肌細(xì)胞死亡過多，ROS產(chǎn)生量無可比性，故未進(jìn)行ROS檢測，從而選擇6 h作為本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)的缺氧時間，而復(fù)氧時間則參考文獻(xiàn)設(shè)定[12, 27-29]。

本研究發(fā)現(xiàn)50 μmol/L和100 μmol/L濃度的CORM-3進(jìn)行缺氧/復(fù)氧干預(yù)時，細(xì)胞內(nèi)ROS的量顯著降低，其中，50 μmol/L的CORM-3效果更好；但當(dāng)繼續(xù)增加CORM-3濃度至200 μmol/L時，細(xì)胞內(nèi)ROS量反而升高，提示CORM-3對缺氧/復(fù)氧的心肌細(xì)胞可能存在“雙刃劍”效應(yīng)，即適當(dāng)濃度時，存在保護(hù)作用；濃度過高時，反而損傷細(xì)胞。此外，為探討CORM-3對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用是否存在時間效應(yīng)，選擇50 μmol/L濃度的CORM-3對缺氧6 h的心肌細(xì)胞分別進(jìn)行復(fù)氧2 h、4 h、6 h、10 h的研究，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行2 h、4 h復(fù)氧時，細(xì)胞內(nèi)ROS量呈現(xiàn)降低，但差異不顯著；但當(dāng)復(fù)氧時間分別延長至6 h、10 h時，細(xì)胞內(nèi)ROS量均呈現(xiàn)顯著降低，其中復(fù)氧6 h的效果更好，提示CORM-3對降低細(xì)胞內(nèi)ROS的量與其復(fù)氧時間相關(guān)。

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