劉新文，黃振光，楊玉芳，丘　岳，溫　燕

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，廣西 南寧　530021)

三七總皂苷通過線粒體途徑抑制順鉑誘導的大鼠腎細胞凋亡

劉新文，黃振光，楊玉芳，丘岳，溫燕

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，廣西 南寧530021)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.61；R329.25；R979.1

摘要：目的探討三七總皂苷(PNS)通過線粒體途徑對順鉑腎損傷大鼠腎組織細胞凋亡的影響。方法將36只♂ SD大鼠隨機分為空白對照組、順鉑模型組、順鉑+PNS組；在給藥8 d后，檢測大鼠血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和尿β-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶(NAG)水平。采用HE染色觀察病理變化，利用透射電子顯微鏡觀察大鼠腎臟線粒體形態(tài)，采用原位末端缺口標記法(TUNEL染色)檢測腎細胞凋亡情況，通過免疫組化SP法檢測凋亡相關蛋白Bax、caspase-9的表達，并采用Western blot檢測Bcl-2蛋白的表達情況。結果與空白對照組比較，順鉑模型組大鼠血清Cr、BUN和尿NAG水平明顯升高(P<0.01)，腎小管上皮細胞線粒體損傷嚴重，腎組織的細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，腎組織Bax、caspase-9及Bcl-2 表達均明顯增強(P<0.01)；與順鉑模型組比較，順鉑+PNS組血清Cr、BUN和尿NAG水平明顯降低(P<0.01)，腎小管上皮細胞線粒體損害明顯改善，腎組織細胞凋亡率和Bax、caspase-9表達水平均明顯降低(P<0.01)，Bcl-2的表達則明顯增強(P<0.01)。結論PNS可能通過增加抑凋亡蛋白Bcl-2表達，減少促凋亡蛋白Bax和凋亡相關蛋白caspase-9的表達來調節(jié)細胞凋亡，從而發(fā)揮保護順鉑腎損害的作用。

關鍵詞:三七總皂苷；順鉑腎損害；線粒體途徑；凋亡；caspase-9；Bax；Bcl-2

順鉑是臨床上最常用的化療藥物之一，主要用于治療多種實體瘤，但它的腎毒性和治療效果均與劑量呈正相關，因此其腎毒性嚴重限制其在臨床上的使用。目前有關順鉑腎毒性的分子機制尚未完全闡明，有研究發(fā)現(xiàn)順鉑可積聚在線粒體內引起線粒體受損，從而誘導腎小管上皮細胞凋亡[1-2]。另外，有報道三七總皂苷(panax nonstaining saponins, PNS)可通過抑制細胞凋亡而對缺血性腦病和糖尿病腎病發(fā)揮保護作用[3-4]。近來，有研究發(fā)現(xiàn)PNS對順鉑腎損傷具有保護作用[5]，但尚未見報道PNS是否可通過抑制細胞凋亡而對順鉑腎損害發(fā)揮保護作用。本實驗從線粒體途徑探討PNS對順鉑誘導的腎細胞凋亡的影響，為進一步研究順鉑腎毒性和PNS的防治作用提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗動物健康♂ Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，體重(200±20) g，SPF級,由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗動物批號：SCXK(桂)2003-0030。

1.2藥品與試劑三七總皂苷粉針劑為廣西梧州制藥(集團)股份有限公司產品，批號20120305；注射用順鉑(凍干型)齊魯制藥有限公司產品，批號3040101DBDB；Bcl-2抗體和Bax抗體購于美國Cell Signaling公司；caspase-9抗體購于英國Abcam公司；內參β-actin抗體購于廣州晶欣生物科技有限公司；熒光二抗羊抗兔抗體購于美國Licor公司；肌酐(serum creatinine，Cr)試劑盒、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)試劑盒、β-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-Glucosaminidase，NAG)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，批號分別為C011-1、C013-2、A031；TUNEL試劑盒購于德國Roche公司。

1.3儀器透射電子顯微鏡(日立H7650，日本)；蛋白質電泳儀、蛋白質轉膜儀(Bio-Rad，美國)；Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LICOR，美國)。

1.4動物分組及給藥36只健康♂ SD大鼠，在代謝籠中適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為以下3組(n=12):(A) 空白對照組(Control組)：d 1～8，大鼠每天接受相同容積的生理鹽水。(B) 順鉑模型組(Cisplatin組)：實驗d 1，大鼠接受單劑量順鉑 (5 mg·kg-1)和相同容積的生理鹽水；d 2～8，每天1次接受同體積生理鹽水。(C) 順鉑+PNS 組(Cisplatin+PNS組)：實驗d 1，大鼠接受單劑量的順鉑 (5 mg·kg-1)和PNS(31.35 mg·kg-1)；d 2～8，每天1次PNS(31.35 mg·kg-1)。B組和C組大鼠給予順鉑來誘導腎損害。順鉑和PNS的劑量是根據本課題組的前期研究結果，課題組的前期研究中，曾以價格昂貴的有一定臨床效果的氨磷汀作為陽性對照藥物，發(fā)現(xiàn)PNS中劑量組降低BUN、Cr的作用與氨磷汀組沒有明顯差異，表明PNS對順鉑腎損害有保護作用[5]。所有藥物均采用腹腔注射給藥。

1.5樣本采集和指標測定

1.5.1血清Cr、BUN和尿NAG測定在實驗d 8，利用代謝籠收集尿液測NAG含量，腹主動脈取血，離心，取血清測Cr、BUN含量；血清BUN水平采用二乙酰一肟法測定，Cr含量采用苦味酸法測定，尿液NAG測定采用對硝基苯酚比色法，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.2腎組織病理形態(tài)學檢查采用HE染色法腎組織經10% 福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋切片后進行HE染色，采用光學顯微鏡進行病理組織學檢查。

1.5.3腎小管上皮細胞線粒體的檢查大鼠腎組織用3%戊二醛固定、PBS漂洗、1%鋨酸后固定1 h，再經過酒精、丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，甲苯胺藍染色后定位、切片，最后經醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色后，利用透射電鏡觀察腎小管上皮細胞的線粒體形態(tài)。

1.5.4TUNEL染色法測定腎組織細胞凋亡率腎組織經10%福爾馬林固定后，采用石蠟包埋切片。按照TUNEL試劑盒說明操作，切片采用熒光素標記，使用POD試劑與熒光素結合，底物用DAB顯色。切片最后經過脫水、透明和封片后，用高倍光學顯微鏡觀察腎組織凋亡細胞。根據凋亡細胞的位置，每張切片隨機取10個視野，計數(shù)高倍視野下凋亡細胞數(shù)，計算每組腎組織凋亡率，細胞核呈棕色的為陽性細胞。凋亡率/%=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%，取其平均值為凋亡指標。

1.5.5SP法免疫組化檢測腎組織Bax與caspase-9的表達腎組織Bax與caspase-9的表達水平采用SP法免疫組化技術檢測。腎組織切片經脫蠟、水化、枸櫞酸修復、山羊血清封閉后，與單克隆一抗(1 ∶500)4℃孵育過夜。次日，切片與相應的生物素標記二抗(1 ∶100)孵育，最后經DAB顯色、質染。胞核藍色，胞質棕黃色為陽性細胞。每組10張切片，每張切片隨機選5個不重疊視野，在400倍光鏡下觀察，并用Image Pro-plus 6.0圖像分析軟件分別對免疫組化及原位雜交染色切片所采集圖像進行測量其陽性面積、光密度和IOD值。

1.5.6Western blot檢測Bcl-2蛋白表達提取腎組織蛋白，100 mg組織加1 mL裂解液，冰上勻漿，充分裂解后離心取上清，使用BCA法檢測組織蛋白濃度，使上樣蛋白濃度為40~60 g·L-1，上樣量為10 μL。取樣品與蛋白上樣緩沖液按4 ∶1混合，煮沸5 min，經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后，使用PVDF膜濕轉50 min，封閉液封閉1 h。然后PVDF膜與Bcl-2一抗抗體(1 ∶1 000)和內參β-actin(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜。次日，3次PBST洗膜后，用熒光二抗(1 ∶15 000)孵育1 h，再經3次PBST洗膜后，采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析。

2結果

2.1大鼠血清Cr、BUN和尿NAG含量如Tab 1所示，順鉑模型組大鼠的血清Cr、BUN和尿NAG水平均明顯高于空白對照組(P<0.01)；而順鉑+PNS組大鼠的血清Cr、BUN 和尿NAG水平均明顯低于順鉑模型組(P<0.01)。

Tab 1Serum BUN，Cr and urinary NAG concentrations

GroupUrineNAG/U·L-1BUN/mmol·L-1Cr/μmol·L-1Blankcontrol1.32±0.542.40±0.62117.03±16.99Cisplatinmodel4.34±0.50**7.08±0.81**209.40±12.30**Cisplatin+PNS1.61±0.41##5.18±0.67**##159.23±24.98**##

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vscisplatin

2.2腎組織HE染色病理檢查結果空白對照組的大鼠腎組織結構未見異常(Fig 1A)。順鉑模型組的腎小管上皮細胞明顯水腫、脫落，腎小管管腔狹窄，可見蛋白質或紅細胞管型(Fig 1B)。順鉑+PNS組的腎組織病理損害較順鉑模型組明顯改善(Fig 1C)。

2.3透射電子顯微鏡檢查腎小管上皮細胞線粒體空白對照組腎小管上皮細胞的結構和形態(tài)未見異常，線粒體形態(tài)正常，結構完整(Fig 2A)。順鉑模型組腎小管上皮細胞的溶酶體增多；線粒體明顯腫脹，是細胞內損傷最嚴重的細胞器，線粒體嵴模糊、斷裂或溶解，可見凋亡小體(Fig 2B)。與順鉑模型組比較，順鉑+PNS組線粒體損傷明顯改善，可見凋亡小體(Fig 2C)。

Fig 1　HE-staining of rat renal tissues in each group

Fig 2　Renal cells of each group observed by electron microscopy

Fig 3　TUNEL-staining of rat renal tissues in each group

2.4PNS 對大鼠腎組織凋亡的影響采用TUNEL染色法檢測腎組織凋亡率。結果顯示，空白對照組大鼠腎組織中少見凋亡細胞(Fig 3A)，而在順鉑模型組大鼠腎組織中凋亡細胞明顯增多，主要集中在腎小管(Fig 3B)。與順鉑模型組比較，順鉑+PN組大鼠腎組織的凋亡細胞明顯減少(Fig 3C)。由Fig 4可知，順鉑模型組大鼠的腎組織細胞凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.01)，而順鉑+PNS組大鼠的腎組織細胞凋亡率明顯低于順鉑模型組(P<0.01)。

2.5PNS對大鼠腎組織Bax、caspase-9蛋白表達的影響SP法免疫組化檢測結果顯示，Bax和caspase-9蛋白主要表達在腎小管上皮細胞(Fig 5)。由Tab 2可知，順鉑模型組的Bax、caspase-9表達水平均明顯高于空白對照組(P<0.01)，分別升高5.38、1.75倍；與順鉑模型組比較，順鉑+PNS組的Bax和caspase-9表達水平均明顯降低(P<0.01)，分別下降50.9%和30.2%。

Fig 4Apoptosis rate of rat renal tissues in each group

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vscisplatin

Fig 5　Expression of Bax and caspase-9 detected by immunohistochemistry

A-C：Bax expression，D-F：caspase-9 expression. A，D：Control；B，E：Cisplatin；C，F(xiàn)：Cisplatin+PNS.

Tab 2Expression of Bax，Bcl-2 and caspase-9 protein

GroupBaxcaspase-9Bcl-2Blankcontrol0.013±0.00540.016±0.00130.11±0.024Cisplatinmodel0.043±0.0050**0.044±0.0034**0.24±0.036**Cisplatin+PNS0.016±0.0041**##0.031±0.0023**##0.38±0.028**##

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vscisplatin

2.6PNS對大鼠腎組織Bcl-2蛋白表達的影響Western blot檢測結果顯示，順鉑模型組大鼠的腎組織Bcl-2蛋白的表達高于空白組，而在順鉑+PNS組中Bcl-2蛋白表達高于順鉑模型組(Fig 6)。由Tab 2可知，順鉑模型組的Bcl-2的表達水平明顯高于空白對照組(P<0.01)，升高3.47倍，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.01)；與順鉑模型組比較，順鉑+PNS組的Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，升高58.3%，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.01)。

Fig 6　Expression of Bcl-2 protein detected by Western blot

A：Control；B：Cisplatin；C：Cisplatin+PNS.

3討論

眾所周知，順鉑可減少腎小球濾過率，升高血清Cr、BUN和尿NAG水平[1，6]，順鉑腎毒性的病理改變主要在腎小管，可表現(xiàn)為腎小管狹窄、蛋白管型，腎小管上皮細胞水腫、壞死，電鏡下可見線粒體嵴斷裂，出現(xiàn)空泡等[7]，這主要與順鉑易在腎小管上皮細胞及其線粒體內積聚有密切關系[2]。本實驗中，順鉑模型組大鼠在暴露于順鉑8 d后，血清Cr、BUN與尿NAG水平均明顯高于空白對照組(P<0.01)；腎組織HE染色可見腎小管上皮細胞水腫，胞質疏松，腎小管管腔狹窄；透射電鏡下見腎小管上皮細胞線粒體明顯腫脹，線粒體嵴模糊不清、斷裂或溶解，說明本實驗的順鉑誘導大鼠腎損傷模型制備成功。

細胞凋亡又稱為細胞程序化死亡，是細胞死亡的一種形式，也是臟器損傷的一個重要指標。研究表明，誘導腎小管上皮細胞凋亡是順鉑腎損傷的重要機制之一[8]。其中，線粒體凋亡途徑是順鉑誘導腎小管上皮細胞凋亡的主要途徑[9]。caspase-9是線粒體凋亡途徑中的關鍵蛋白及啟動子[10]。當線粒體凋亡通路被順鉑激活時，線粒體中的細胞色素C釋放到細胞質，參與形成凋亡體。caspase-9與凋亡體結合能有效激活下游caspase酶，包括caspase-3/6/7，最終導致細胞凋亡[7]。本實驗中，順鉑模型組大鼠腎細胞凋亡率明顯高于空白對照組，提示順鉑腎毒性與其誘導腎組織細胞凋亡有關，這與文獻報道一致[10]。同時，順鉑模型組大鼠腎組織caspase-9的表達水平明顯高于空白對照組，這與線粒體損傷以及腎細胞凋亡率的變化相符合，提示順鉑誘導腎組織的細胞凋亡與caspase-9依賴的線粒體通路密切相關。

順鉑誘導細胞線粒體凋亡的信號傳導主要受Bcl-2家族基因的調控，其中包括促凋亡基因Bax與抗凋亡基因Bcl-2。研究發(fā)現(xiàn)，當細胞受到順鉑刺激時，Bax基因被激活而使Bax蛋白表達增多，并發(fā)生構象改變，通過其疏水性的C端結合到線粒體膜上，導致線粒體滲透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)形成，引起細胞色素C釋放，從而促進凋亡[11]。而另一種細胞凋亡相關蛋白Bcl-2的作用恰恰與Bax相反，Bcl-2可通過多種途徑來穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制細胞色素C的釋放，從而抑制線粒體途徑的細胞凋亡[12]。凋亡基因Bax與Bcl-2的比值是調節(jié)細胞凋亡的關鍵，當Bcl-2高表達時，可以與Bax形成異源二聚體，抑制凋亡；而Bax高表達時，則形成Bax/Bax同源二聚體，促進細胞凋亡。本實驗中，順鉑模型組腎組織Bax的表達水平明顯高于空白對照組，提示細胞受順鉑刺激后應激性地增強Bax蛋白的表達，從而促進線粒體途徑的細胞凋亡。

PNS是從中國傳統(tǒng)中藥三七中提取的有效部位，主要有三七皂苷Rl，以及人參皂苷Rgl、Rbl、Re、Rd等多種成分，具有抗氧化、抗增殖、抗凋亡等活性[13]，并且可降低順鉑誘導的腎損傷[6]。在本實驗中，PNS可明顯降低大鼠血清Cr、BUN和尿NAG水平，明顯改善腎小管壞死程度以及腎小管上皮細胞線粒體的損傷程度，說明PNS對順鉑誘導的大鼠腎損傷有保護作用，這與報道相符[5-6]。本實驗還發(fā)現(xiàn)，PNS可明顯降低腎組織的細胞凋亡率，提示PNS可通過抑制腎組織的細胞凋亡而發(fā)揮保護腎臟細胞的作用。另外，本實驗結果顯示，PNS可使腎組織的Bax蛋白、caspase-9表達水平明顯降低，而Bcl-2蛋白表達則明顯增強(P<0.01)，所以，Bax/Bcl-2比值明顯降低。結合電鏡下PNS能改善順鉑引起的線粒體損害的病理結果，提示PNS可能通過下調促凋亡蛋白Bax和上調抑凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而抑制順鉑誘導的caspase依賴性線粒體通路的腎細胞凋亡，達到保護腎組織細胞的作用。這是首次有關PNS通過抑制腎細胞凋亡而保護順鉑腎損害的報道。

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網絡出版時間：2015-1-9 13:37網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.014.html

Panax notoginseng saponins can inhibit apoptosis of renal cells induced

by cisplatin through path of mitochondrion

LIU Xin-wen，HUNAG Zhen-guang，YANG Yu-fang，QIU Yue，WEN Yan

(DeptofPharmacy，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Abstract:AimTo investigate the effects of panax nonstaining saponins(PNS) on the apoptosis of renal cells induced by cisplatin through the path of mitochon-drion. MethodsMale Sprague-Dawley(SD) rats were randomized divided into normal control group， cisplatin model group and the cisplatin+PNS group，with 12 rats of each group. Animals were sacrificed to determine the N-acetyl-β-D-Glucosaminidase(NAG) in urine，blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (Cr) concentrations after 8d of intraperitoneal injection. HE-staining was employed to observe renal pathologies. Transmission electron microscopy (TEM) was employed to observe the mitochondria of the rats′ injured kidney region．TUNEL staining was employed to detect the distribution of apoptotic cells. Immunnohistochemistry was used to detect Bax and caspase-9 expression，and expression of Bcl-2 protein was detected by Western blot. ResultsCompared with the normal control group，contents of BUN，serum Cr and urinary NAG levels of rat in the cisplatin model group were increased(P<0.01)，and some mitochondria of the epithelial cells of renal tubules got injured seriously. The apoptosis rate of kidney cell was increased (P<0.01).The expression of Bax，caspase-9 and Bcl-2 proteins was increased (P<0.01). Compared with the cisplatin model group，contents of BUN，serum Cr and urinary NAG levels of rats in the cisplatin model group were decreased(P<0.01)，and some mitochondria of the epithelial cells of renal tubules were significantly improved.The apoptosis rate of kidney cell was decreased (P<0.01).The expression of Bax and caspase-9 protein was decreased (P<0.01)，but Bcl-2 protein was increased(P<0.01). ConclusionPNS may increase the expression of Bcl-2 protein and decrease the expression of Bax and caspase-9 proteins，which may play a protective role in cisplatin nephritic damage.

Key words：panax notoginseng saponins(PNS)；cisplatin-induced renal damage；mitochondria pathway；apoptosis；caspase-9；Bax；Bcl-2

通訊作者楊玉芳(1969-)，女，博士,主任藥師，研究方向：藥源性疾病的防治,,Tel:0771-5356154，E-mail：yyf69@163.com

作者簡介：劉新文(1990-)，男，碩士生，研究方向：藥源性疾病的防治，E-mail：liuxinwen822@163.com;

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81260598)

收稿日期：2014-11-09，修回日期：2014-12-13

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0216-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.014