趙若琳,周坤福,張　旭,陳美娟

(南京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京　210023)

桔梗皂苷-D抑制非小細胞肺癌H460和A549細胞黏附、侵襲和遷移的作用機制研究

趙若琳,周坤福,張旭,陳美娟

(南京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210023)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R329.2；R734.202.2；R977.3

摘要：目的探究桔梗皂苷-D(platycodin-D，PD)抑制非小細胞肺癌(NSCLC) H460和A549細胞黏附、侵襲和遷移的作用及其作用機制。方法細胞黏附實驗、劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗分別檢測細胞黏附、遷移和侵襲能力。RT-PCR檢測H460和A549細胞中MMP-2和MMP-9 mRNA的表達。同時，Western blot法檢測MMP-2和MMP-9蛋白、其上游ERK信號通路相關蛋白和p-Akt的表達水平。結果PD有效抑制H460和A549細胞黏附、侵襲和遷移能力，并呈濃度依賴性(P<0.05)。PD降低H460和A549細胞中MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(P<0.01);同時，PD下調H460和A549細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達，并抑制其上游Ras、p-c-Raf、p-ERK 1/2和p-Akt的表達,并呈濃度和時間依賴性。結論PD抑制NSCLC細胞黏附、侵襲和遷移，并且此作用與下調MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達，抑制其上游ERK信號通路和p-Akt表達有關。

關鍵詞：桔梗皂苷-D；非小細胞肺癌；黏附；侵襲；遷移；基質金屬蛋白酶-2; 基質金屬蛋白酶-9

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，全球每年有138萬肺癌新增病例和超過100多萬人死于肺癌，其中，非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%~85%，其5年生存率不到15%[1]。NSCLC患者中，約30%的患者在診斷時就已發(fā)生遠處轉移，50%~60%的患者在治療過程中發(fā)生遠處轉移，并且最終80%~90%的患者都死于肺癌的轉移[2]。因此，抑制和預防肺癌細胞轉移是治療NSCLC和提高患者生存率的關鍵。腫瘤轉移受多因素、多步驟調控，主要包括腫瘤細胞間黏附力降低，而與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)黏附力增強、降解ECM和基底膜、腫瘤細胞遷移、侵襲能力的增強，從而進入血流或淋巴系統(tǒng)，最終到達靶器官形成新的腫瘤生長[3]。因此，抑制NSCLC細胞黏附、侵襲和遷移是抑制其轉移的基礎。中藥桔梗在臨床上常用于治療肺部和呼吸系統(tǒng)疾病，桔梗皂苷-D(platycodin-D，PD)是從其中分離提取的一種三萜類單體，它是桔?？拱┑闹饕行С煞?。近年國內外的研究發(fā)現，PD對肺癌、胃癌、乳腺癌和人白血病等多種腫瘤細胞具有抑制增殖和誘導凋亡作用[4-5]。此外,在PD抑制腫瘤轉移方面，研究僅發(fā)現PD單獨或聯(lián)合蛇床子對乳腺癌侵襲和遷移具有抑制作用[5-6]，然而，其對NSCLC侵襲和遷移的研究尚未開展。本實驗旨在探究PD對兩種NSCLC細胞肺大細胞肺癌H460和肺腺癌細胞A549黏附、侵襲和遷移能力的影響及其作用機制，為PD抑制NSCLC轉移提供實驗基礎和依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑桔梗皂苷-D，分子量1224.58，上海源葉生物科技有限公司，批號：20110402。該化合物最初溶于二甲亞砜(DMSO)，為使用前的原液(DMSO的最終濃度小于0.01%)。RPMI 1640和DMEM/F12培養(yǎng)液：HyClone, USA；胎牛血清：Gibco, USA；磷酸緩沖鹽(PBS)：Solarbio；胰酶、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)、牛血清蛋白(BSA)、凝膠試劑盒：碧云天；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)：Millipore，Germany；Transwell小室：Corning，USA；抗體均為美國Cell Signaling公司；TRIzol: Invitrogen，America；cDNA第一鏈合成試劑盒：Fermentas，Lithuania；Realtime PCR Master Mix(SYBR Green) ：Toyobo，Japan。

1.1.2儀器CO2細胞培養(yǎng)箱 (日本SANYO公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；自動酶標儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；倒置熒光相差顯微鏡、熒光顯微鏡、圖像獲取系統(tǒng)(日本Olympus公司)；熒光定量PCR循環(huán)儀(中國中山達安)；核酸電泳儀(中國北京六一)；PCR循環(huán)儀、高速低溫離心機(美國Labnet公司)；流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.1.3細胞株肺腺癌A549細胞和肺大細胞肺癌H460細胞，購自中國科學院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液中；將H460細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。置37 ℃、體積分數為 5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗時取對數生長期細胞。

1.2.2細胞黏附實驗96孔培養(yǎng)板包被：每孔加入CollagenⅠ溶液50 μL，置37 ℃、5% CO2孵箱孵育1 h；PBS洗2次，加入3% BSA 0.2 mL，孵育2 h，PBS再洗2次，備用。分別取不同濃度PD(0、5、10、20、30 μmol·L-1)作用24 h后的H460和A549細胞，經洗滌、消化后用含10%胎牛血清DMEM液稀釋，調整細胞濃度為8×108·L-1，分別加入到包被過的96孔板，每孔100 μL，每組設5個平行復孔，37 ℃、5% CO2條件下溫育2 h。溫育結束后棄去各孔培養(yǎng)液，PBS沖洗，除去未黏附細胞，每孔加50 μL MTT使用液(PBS溶解，1×103mg·L-1)，細胞培養(yǎng)箱溫育3 h。吸棄MTT使用液，每孔加DMSO 150 μL，溶解結晶后，酶標儀測波長570 nm下各孔OD值。以PD(0 μmol·L-1)組為空白對照組，黏附抑制率=(1-實驗組OD值 / 對照組OD值)×100%。

1.2.3劃痕實驗取對數生長期的H460和A549細胞，按每孔 1×106個接種于6孔板中，待細胞貼壁長到 90%時，用20 μL移液器槍頭在每孔的中間垂直劃線。然后用PBS洗滌3次，去除掉落的細胞，加入PD (0、30 μmol·L-1)處理后，置37 ℃、5%的 CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于鏡下觀察PD作用0、6、12、24、48 h后劃痕寬度變化并拍照(×100),每組實驗重復 3 次。分別計算3條平行劃痕的平均寬度(每條劃痕各取3個固定位置計算寬度)。劃痕愈合率/%=(初始劃痕寬度-指定時間的劃痕寬度)/ 初始劃痕寬度×100%。

何小勇悉心照料著青瓷，給她洗衣服，給她做飯，他把所有能想到的能討好她的方法都用盡了。然后有一天就傳來王金貴被打的消息，躺在醫(yī)院里兩天才把小命搶救過來。

1.2.4Transwell小室侵襲實驗Transwell小室含有基質，膠纖維膜孔徑為8 μm，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，上室加入100 μL不含胎牛血清的培養(yǎng)液，然后按照1×108·L-1在上室加入PD(0、10、 20、30 μmol·L-1)處理后的細胞懸液30 μL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取出濾膜，甲醇固定，姬姆薩染色，顯微鏡下每張濾膜隨機取5個視野(×200)，計數穿膜細胞數，取平均數表示每種腫瘤細胞的侵襲能力。

1.2.5RT-PCR采用TRIzol細胞裂解法提取組織RNA，測定樣品RNA在波長260和280 nm處的吸光度比值，檢測其純度和濃度。設計并合成擴增引物序列及PCR產物大小：Human-GAPDH primer (132 bp),Sense primer: 5′-ATCGTGGAAGGACTCA-3′，Antisense primer: 5′-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′；Human-MMP2 primer (146 bp)，Sense primer:5′-CTACTGAGTGGCCGTGTTTG-3′，Antisense primer: 5′-GGAAGCTCTGACCTTTCCAG-3′；Human-MMP9 primer (136 bp)，Sense primer: 5′-TCTTCCAAGGCCAATCCTAC-3′，Antisense primer: 5′-ATCACCGTCGAGTCAGCTC-3′。cDNA合成條件：取2 μg提取RNA,加入20 μL的反應體系中，PCR擴增條件：逆轉錄產物用無核酸酶的水稀釋10倍，取20 μL用于擴增，95 ℃ 5 min， 94 ℃ 15 s， 60 ℃ 20 s， 72 ℃ 40 s，共40個循環(huán)；每秒升高0.1 ℃直至升高到95 ℃停止。取10 μL PCR產物經2%瓊脂糖電泳鑒定，緩沖液冷卻循環(huán)器凝膠圖像分析系統(tǒng)攝片，并分析其光密度，結果以目的基因與內參基因(Human-GAPDH)吸光度的比值2-ΔΔCT表示。

1.2.6Western blot 檢測細胞內相關蛋白變化取對數生長期的細胞消化接種到6孔板中，細胞密度為5×108·L-1，藥物處理一定時間后，收集細胞PBS洗滌2次，每孔加入細胞裂解液200 μL，1200 r·min-1離心20 min。蛋白定量：取蛋白，加入4×上樣緩沖液，100℃下變性5 min。15%的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后依次加入第一、二抗體，在室溫下孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，滴加ECL發(fā)光試劑，于凝膠成像系統(tǒng)曝光。

2結果

2.1PD對H460和A549細胞黏附能力的影響不同濃度的 PD(0、5、10、 20、30 μmol·L-1)分別作用 H460和A549細胞 24 h 后[PD(0 μmol·L-1)組為空白對照組]，采用細胞黏附實驗檢測細胞黏附能力。結果表明，PD 作用后，H460和A549細胞黏附能力都逐漸減弱，即細胞黏附抑制率皆逐漸升高，并呈濃度依賴性(Tab 1)，與PD(5 μmol·L-1)組的細胞黏附抑制率相比，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Tab 1Effects of PD on cell adhesion ability in H460

GroupOD570nmH460A549Inhibitionrateofcelladhesion/%H460A549PD0μmol·L-10.737±0.020.328±0.0100PD5μmol·L-10.646±0.050.277±0.0212.31%15.54%PD10μmol·L-10.505±0.040.234±0.0231.45%**28.60%*PD20μmol·L-10.490±0.030.199±0.0133.56%**39.32%**PD30μmol·L-10.437±0.020.189±0.0140.64%**42.48%**

*P<0.05，**P<0.01vsPD 5 μmol·L-1

2.2PD對H460和A549細胞遷移能力的影響采用劃痕實驗檢測PD對H460和A549細胞遷移能力的影響。如Fig 1所示，PD(30 μmol·L-1)分別作用H460和A549細胞0、6、12、24、48 h后，劃痕寬度逐漸增大，劃痕兩側的細胞密度逐漸減少；相反，H460和A549細胞的空白對照組(Control)生長0、6、12、24、48 h后，劃痕寬度逐漸減小，劃痕兩側的細胞密度逐漸增大。同時，兩種細胞的Control組劃痕愈合率逐漸增大，PD(30 μmol·L-1)作用組逐漸減小，并且與同一作用時間的Control組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見Tab 2。

Fig 1　Effects of PD on cell migration ability of H460 and A549 cells(n=3)

**P<0.01 vs control

GroupWound-healingrateofcontrolgroup/%H460A549Wound-healingrateofPD30μmol·L-1group/%H460A5496h6.6713.63-3.23**-9.37**12h10.0527.27-9.67**-12.51**24h13.3550.11-16.13**-24.38**48h20.0363.62-16.50**-25.15**

**P<0.01vscontrol

2.3PD對H460和A549細胞侵襲能力的影響Transwell小室侵襲實驗檢測PD對H460和A549細胞侵襲能力的改變，結果發(fā)現，PD(10、20、30 μmol·L-1)作用 24 h 后，H460和A549細胞的處理組穿過微孔濾膜的細胞數明顯低于對照組(P<0.01)，并呈濃度依賴性(Fig 2)。

2.4PD對H460和A549細胞中MMP-2和MMP-9基因水平的調控利用RT-PCR進一步研究PD對H460和A549細胞中與癌細胞黏附、侵襲和遷移密切相關的金屬蛋白酶-2(MMP-2)和金屬蛋白酶-9(MMP-9)mRNA水平的調控。如Tab 3所示，PD有效抑制了H460和A549細胞中MMP-9 和 MMP-2 mRNA的表達，并隨PD濃度增加抑制作用增強，與Control組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

Tab 3Effects of PD on mRNA expression levels of

GroupMMP-2(2-ΔΔCT)H460A549MMP-9(2-ΔΔCT)H460A549Control1.000±0.0151.000±0.0111.000±0.0141.000±0.024PD20μmol·L-10.360±0.009**0.376±0.006**0.408±0.008**0.513±0.013**PD30μmol·L-10.174±0.057**0.155±0.005**0.119±0.016**0.164±0.002**

**P<0.01vscontrol

Fig 3　Regulation of expression levels of MMP-2/9, upstream

3討論

NSCLC占肺癌的80%～85%，具有低生存率、高轉移率的特點，并且80%～90%的NSCLC患者死亡和復發(fā)是由轉移引起的。桔梗入藥始載于《神農本草經》，味苦、辛，性平，歸肺經，臨床上以桔梗為主藥組成方劑治療急性上呼吸道感染、肺膿瘍、肺膿腫、肺癌和縱隔腫瘤等肺部疾病，均取得較好的療效[7]。PD是從中藥桔梗中分離提取的一種三萜類單體，是桔?？拱┳饔玫挠行С煞?，其對多種腫瘤細胞具有殺傷作用。在抑制腫瘤轉移方面，現僅有文獻報道PD具有抑制乳腺癌侵襲和遷移作用，PD對肺癌轉移的影響及其機制研究尚未開展。

腫瘤轉移是多基因、多因素、多步驟的生物學行為。降低癌細胞與ECM間黏附力是癌細胞轉移的開始，本實驗首先由細胞黏附實驗探究PD作用后H460和A549細胞與ECM蛋白CollagenⅠ黏附能力的改變，結果表明PD降低兩種細胞黏附能力，并呈濃度依賴性。癌細胞與ECM黏附后，侵襲ECM和基底膜，分泌多種蛋白水解酶，降解ECM和基底膜，使細胞穿越破損的基底膜脫離、遷離原發(fā)灶，進而隨血液或淋巴循環(huán)發(fā)生腫瘤轉移[8]。因此，降低癌細胞侵襲和遷移能力是抑制腫瘤轉移的關鍵。本實驗通過劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗發(fā)現，PD有效抑制H460和A549細胞遷移和侵襲。

ECM和基底膜的改變是腫瘤浸潤轉移的重要環(huán)節(jié)。Ⅳ型膠原纖維是ECM和基底膜的重要組分之一，金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)中的MMP-2和MMP-9能有效地將其降解[9]。研究證實，MMP-2和MMP-9不僅可以降解ECM和基底膜，參與腫瘤黏附、侵襲和血管的侵入，而且與原發(fā)及轉移瘤的生長、腫瘤的血管生成及腫瘤惡變有關[10]。此外，在多種具有侵襲性和高轉移腫瘤中都發(fā)現有MMP-2和MMP-9的表達增高。目前，研究表明MMP-2和MMP-9的表達水平與肺癌的分期、轉移和預后密切相關[11]。因此，抑制MMP-2和MMP-9的表達是抑制NSCLC侵襲和遷移的關鍵。采用RT-PCR 和Western blot研究發(fā)現，PD作用H460和A549細胞后，不僅在基因水平降低細胞中MMP-9 和 MMP-2 mRNA的表達，而且在蛋白質的水平下調H460和A549細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達，并呈時間和濃度依賴性。因此，PD抑制NSCLC細胞黏附、侵襲和遷移與抑制MMP-2和MMP-9的表達有關。

大量研究證明，MMP-9和MMP-2的表達主要受上游絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族(MAPKs)信號通路的調控。激活MAPKs通路可上調MMP-2和MMP-9的表達，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，反之，則抑制腫瘤侵襲轉移[12]。MAPKs信號通路主要包括細胞外信號調節(jié)激酶 (extracellular signal-regulated kinase, ERK)通路、p38 MAPK通路和c-Jun-N端激酶(JNK)通路。并且，ERK信號通路即Ras/Raf/ERK信號通路在許多腫瘤的增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡過程中起主要作用[13]。本實驗通過對Ras/Raf/ERK信號通路進一步研究發(fā)現，PD可下調H460和A549細胞中Ras、p-c-Raf和p-ERK 1/2的表達，并呈濃度和時間依賴性。因此，PD抑制MMP-9和MMP-2表達可能與抑制其上游ERK信號通路有關。

此外，Akt通過激活MMP-9和MMP-2促進腫瘤的侵襲和遷移[13-14]。因此，抑制Akt的表達被作為抑制腫瘤轉移的調控靶點。并且研究發(fā)現，Akt的激活即形成磷酸化的Akt(p-Akt)與NSCLC的轉移密切相關，p-Akt的過表達可以提高NSCLC黏附、侵襲和轉移能力[15]。本實驗研究表明，PD抑制H460和A549細胞中p-Akt的表達，并且呈濃度和時間依賴性。

綜上，本實驗結果首次證明了PD抑制NSCLC細胞H460和A549細胞黏附、侵襲和遷移，其作用與下調MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達及抑制其上游ERK信號通路和p-Akt表達有關。由此表明，PD具有較好的抗NSCLC轉移作用，為PD的進一步藥物研發(fā)和臨床應用提供了實驗基礎和依據。然而，PD抑制MMP-2和MMP-9表達上游多個信號通路調控，和信號中的關鍵靶蛋白及其對應的靶基因，有待通過靶蛋白抑制劑和siRNA沉默干擾技術深入研究，并且亟需通過體內實驗進一步驗證PD抑制NSCLC轉移的作用。

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網絡出版時間：2015-1-9 13:37網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.019.html

Research on mechanisms of PD-induced inhibition of adhesion, invasion

and migration in non-small cell lung cancer H460 and A549 cells

ZHAO Ruo-lin, ZHOU Kun-fu, ZHANG Xu, CHEN Mei-juan

(SchoolofBasicMedicalSciences,NanjingUniversityofChineseMedicine，JiangsuCollaborative

InnovationCenterofTCMPreventionandTreatmentofTumor,Nanjing210023,China)

Abstract:AimTo explore the effects of the inhibition of cell adhesion, invasion and migration in non-small cell lung cancer (NSCLC) H460 and A549 cells induced by platycodin-D (PD) and its mechanism. MethodsCell adhesion assay, wound-healing assay and Transwell chamber migration assay were used to detect the ability of cell adhesion, migration and invasion. Regulation of MMP-2 and MMP-9 mRNA was determined by RT-PCR. Meanwhile, Western blot was performed to determine the expression levels of MMP-2/9, its upstream related proteins of ERK signaling pathway and p-Akt. ResultsPD effectively inhibited the ability of cell adhesion, invasion and migration in H460 and A549 cells in a dose-dependent manner (P<0.05). PD reduced the expression of MMP-2 and MMP-9 mRNA in H460 and A549 cells (P<0.01); meanwhile, PD down-regulated the expression levels of MMP-2/9, and inhibited the expression of its upstream proteins Ras, p-c-Raf, p-ERK 1/2 and p-Akt in a time- and dose-dependent manner. ConclusionsPD inhibits cell adhesion, invasion and migration in NSCLC cells, and these effects are related to the down-regulation of the expression of MMP-2 and MMP-9 mRNA and protein, and inhibition of its upstream expression of ERK signaling pathway and p-Akt.

Key words:platycodin-D; non-small cell lung cancer; adhesion; invasion; migration; matrix metalloproteinase-2(MMP-2); matrix metalloproteinase-9(MMP-9)

通訊作者周坤福(1960-)，男，博士，副教授，研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤及其機制，,Tel:025-85811037,E-mail：zhoukunfu@sina.com

作者簡介：趙若琳(1987-)，女，碩士生，研究方向：中藥單體抗腫瘤及其機制，E-mail：bunny871201@163.com;

基金項目：江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程項目(PAPD)；歐盟第七框架項目(No PIRSES-GA-2013-612589)；江蘇自然基金資助項目(No BK20131415)

收稿日期:2014-10-29,修回日期:2014-12-03

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0241-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.019