孫　瑤，張　嬋，簡　潔

(桂林醫(yī)學院藥學院，廣西 桂林　541004)

九龍?zhí)倏傸S酮調控自噬對抗心肌缺血/再灌注損傷的實驗研究

孫瑤，張嬋，簡潔

(桂林醫(yī)學院藥學院，廣西 桂林541004)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R329.24；R329.411；R542.2；R619.9

摘要：目的研究九龍?zhí)倏傸S酮(Bauhinia championii flavones, BCF)調控自噬抗心肌缺血/再灌注損傷的作用。方法120只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、BCF高劑量組、BCF低劑量組、自噬抑制劑(3-MA)組(n=8)，采用左冠狀動脈前降支結扎法制備大鼠心肌缺血/再灌注模型，以紫外分光光度法檢測缺血30min、缺血/再灌注1 h及3 h時肌酸激酶同工酶(CK-MB)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、總抗氧化力(T-AOC)的含量；以Western blot法檢測心肌微管相關蛋白輕鏈3蛋白-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin-1、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的表達。結果與模型組相比，BCF能劑量依賴性提高心肌缺血/再灌注不同時段的T-AOC，降低CK-MB及iNOS含量，下調LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達，上調mTOR蛋白表達(P<0.05或P<0.01)；與3-MA組相比，BCF能夠降低iNOS及CK-MB，提高T-AOC水平，缺血期上調LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達，再灌注期下調LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達，缺血/再灌注期均下調mTOR蛋白表達(P<0.05)。結論自噬在心肌缺血期即發(fā)生，并隨著缺血/再灌注時間延長而進一步加強；BCF預處理可促進缺血期自噬發(fā)生及抑制再灌注時自噬過表達，從而減輕心肌缺血/再灌注損傷。

關鍵詞：九龍?zhí)倏傸S酮；調控；自噬；不同時段；缺血/再灌注損傷；保護作用

自噬是維持心肌細胞形態(tài)、結構和功能的關鍵調節(jié)因子，其在心臟疾病調節(jié)中具有雙刃劍作用[1-2]：既可以延緩疾病進程，促進損傷恢復，也可以導致細胞死亡。Beclin-1介導的自噬/凋亡互反饋信號通路和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)介導的自噬/mTOR互反饋信號通路，是兩條經(jīng)典的自噬信號途徑[3]。此外，Bcl-2和NF-κB亦影響自噬的功能[4]：Bcl-2和Beclin-1的平衡狀態(tài)決定了自噬的作用，Bcl-2表達下調不僅可以誘發(fā)凋亡，而且可以通過激活Beclin-1來激活自噬，而激活NF-κB則可通過下調Beclin-1表達抑制自噬、促進凋亡。自噬的發(fā)生機制、調控因素及藥物干預是目前心臟疾病研究領域的一個熱點。

九龍?zhí)?別名過崗龍、過江龍等)為廣西特色中草藥，屬豆科羊蹄甲屬植物龍須藤[Bauhiniachampionii(Benth.)Benth.]的干燥藤莖，富含黃酮類成分[5]。課題組前期研究證明[5-7]，九龍?zhí)倏傸S酮(Bauhiniachampioniiflavones, BCF)能夠增加心肌細胞活力；降低LDH、增加ATPase活性，改善心肌代謝；降低iNOS、增加eNOS、減少肌酸激酶同工酶、心肌肌鈣蛋白1、肌紅蛋白含量，減輕垂體后葉素所致心肌缺血損傷；上調Bcl-2、下調Bax、NF-κB p65蛋白表達、降低TNF-α含量，抑制心肌細胞凋亡，對心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion，MIRI)具有明顯的保護作用。上述作用涉及多個自噬信號通路靶點如ATPase、TNF-α、NOS、Bcl-2家族、NF-κB等，那么，BCF是否通過抑制凋亡，下調Beclin-1蛋白表達，進而抑制自噬？它對mTOR又有何作用？基于此思路，本文以自噬標志物LC3-Ⅱ，自噬相關蛋白Beclin-1、mTOR為主要指標，探討B(tài)CF預處理對心肌缺血/再灌注不同時段自噬的調控作用，為進一步的新藥研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1材料

1.1動物SPF級SD大鼠，♂，體質量250～280 g，由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供，許可證：SCXK(桂)2010-0002。

1.2藥物與試劑BCF(本室分離純化，總黃酮含量以蘆丁計為82%，用含2%DMSO的生理鹽水溶解備用)；自噬抑制劑3-Methyladenine(3-MA，美國Cayman公司，貨號：13242)；肌酸激酶同工酶(CK-MB，貨號：E006)、總抗氧化力(T-AOC，貨號：A015)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS，貨號：A014-1)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；LC3-Ⅱ抗體(美國Epitomics公司，貨號：ab52768)；mTOR(貨號：7C10)、Beclin-1(貨號：D40C5)抗體均購于美國CST公司。

1.3主要儀器BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；小動物呼吸機DW-3000(上海嘉鵬科技有限公司)；Model 1450型自動酶標儀(美國BIORAD公司)；冷凍離心機MikRro220R(美國Beckman公司)；UV2550紫外分光光度計(日本島津公司)；JY300C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；培清JS-780全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)。

2方法

2.1動物分組造模及給藥將120只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、BCF高劑量組(BCFH,20 mg·kg-1)、BCF低劑量(BCFL,10 mg·kg-1)、3-MA組(15 mg·kg-1)(n=8)，各組于造模前10 min舌下靜脈給藥(假手術組及模型組給予同體積含2%DMSO的生理鹽水)，按文獻方法[7]建立大鼠心肌缺血(缺血30 min)及缺血/再灌注損傷(缺血30 min再灌注1 h及3 h)模型，以心電圖QRS波幅加大，ST段抬高，T波高聳或倒置作為缺血成功與否判斷標準；復灌后，上述各指標逐步恢復即為再灌注成功。

2.2指標檢測及測定方法

2.2.1血清T-AOC、iNOS及CK-MB含量測定造模結束，各組動物在相應的時間點經(jīng)腹主動脈取血5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，取上清，按試劑盒說明書檢測血清T-AOC、iNOS、CK-MB含量。

2.2.2Western blot檢測LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR的蛋白表達各組動物在相應的時間點，取心臟，用預冷的生理鹽水充分洗凈殘血，取部分結扎線以下左心室組織60 mg，濾紙吸干、剪碎、液氮研磨，用RIPA裂解總蛋白并定量，SDS-PAGE電泳，轉膜橫流90 mA，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光，X線片顯影、定影后用SensiAnsys凝膠圖像分析系統(tǒng)測其灰度值。

3結果

3.1心電圖從Fig 1可見，結扎大鼠冠狀動脈左前降支30 min后心電圖ST段明顯抬高，說明造模成功。BCF預處理可抑制造模后心肌ST段抬高，3-MA對抬高的ST段無影響。

Fig 1Changes of electrocardiogram in each group

3.2血清生化指標檢測從Tab 1、2可見，模型組大鼠血清T-AOC明顯降低，iNOS及CK-MB明顯升高(P<0.05vsSham)；與模型組相比，BCF能增強總抗氧化力，降低iNOS及CK-MB含量，并呈劑量依賴性(P<0.05或P<0.01)；3-MA在缺血期對血清T-AOC、iNOS及CK-MB影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，再灌注期能改善總抗氧化力，在一定程度上降低iNOS及CK-MB含量(P<0.05)。與3-MA組相比，BCF降低血清iNOS及CK-MB含量，提高T-AOC水平(P<0.05)。

3.3心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR蛋白表達與假手術組相比，模型組心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin-1及mTOR蛋白表達量增加(P<0.05)。與模型組相比，BCF在缺血/再灌注3個時段均可劑量依賴性地降低LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達，提高mTOR蛋白表達(P<0.05或P<0.01)。與3-MA組相比，BCF對缺血期LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達上調作用更強；在再灌注期，BCF抑制LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表達；BCF在缺血/再灌注期均下調mTOR蛋白表達(P<0.05)。結果見Fig 2-4。

GroupDose/mg·kg-1iNOS/kU·L-1Ischemia30minI/R1hI/R3hCK-MB/U·L-1Ischemia30minI/R1hI/R3hSham-8.07±0.36**7.67±0.31**7.91±0.28**21.18±2.78**20.45±3.31**22.33±2.95**Model-13.14±0.30△16.09±0.47△19.22±0.91△166.04±19.91△190.24±18.58△225.87±22.37△BCFH209.74±1.02**#11.14±0.97**#13.73±0.77**#78.71±6.12**#95.78±8.95**#115.23±7.41**#BCFL1010.97±1.02*#12.54±0.69**14.84±0.93**#94.72±2.30**#110.92±9.55**#130.55±8.50**#3-MA1512.57±1.2713.38±0.68*16.32±0.52*152.31±7.46152.46±15.17*177.04±12.60*

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;△P<0.05vssham;#P<0.05vs3-MA

Tab 2Effects of BCF on contents of T-AOC in

GroupDose/mg·kg-1T-AOC/kU·L-1Ischemia30minI/R1hI/R3hSham-14.28±0.39**13.23±0.80**13.95±0.61**Model-7.71±0.75△7.64±0.92△6.79±0.66△BCFH2011.16±1.36**#11.29±0.68**#9.12±0.61**#BCFL1010.30±1.04**#9.87±0.42*#8.74±0.87**3-MA158.72±0.538.89±0.79*8.51±0.92*

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;△P<0.05vssham;#P<0.05vs3-MA

Fig 2Results of Western blot in rats with

myocardial ischemia 30 min

*P<0.05vsmodel;△P<0.05vssham;#P<0.05vs3-MA

4討論

Fig 3Results of Western blot in rats with

myocardial ischemia/reperfusion 1 h

*P<0.05vsmodel;△P<0.05vssham;#P<0.05vs3-MA

Fig 4Results of Western blot in rats with

myocardial ischemia/reperfusion 3 h

*P<0.05vsmodel;△P<0.05vssham;#P<0.05vs3-MA

機體中總抗氧化能力的強弱，直接影響到心肌細胞的生存狀態(tài)。心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/ reperfusion injury，MIRI)發(fā)生時，大量鈣離子內流、線粒體ATP生成減少、細胞內活性氧、NO增多[7]，細胞內活性氧可以促進自噬的發(fā)生，而抗氧化力增高則可抑制細胞過度自噬[9]。前期實驗[10]表明BCF可以抑制CaR蛋白表達、減少鈣離子內流，增強ATP酶活性，Tab 1-2亦顯示BCF降低iNOS，增強總抗氧化力而減輕自噬。CK-MB是臨床上常用的心肌損傷標志物[11]，其含量隨著缺血/再灌注時間推移而升高。與模型組相比，自噬抑制劑3-MA對缺血期CK-MB含量無影響(P>0.05)，表明其抑制缺血期少量自噬發(fā)生對心肌的保護作用；在再灌注期，3-MA則通過抑制自噬的過度表達，進而減少心肌損傷標志物CK-MB的漏出(P<0.05)。與模型和3-MA組相比，BCF預處理均可劑量依賴性地減少心肌缺血期及再灌注期的CK-MB含量(P<0.05)，其對心肌損傷的保護作用是否與促進缺血期自噬發(fā)生或(和)抑制再灌注期自噬過表達有關？基于此思路，我們選擇LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR為切入點，進一步了解BCF對MIRI保護作用與影響自噬的關聯(lián)。

LC3-Ⅱ是自噬的標志性蛋白，直接反映自噬發(fā)生程度[2]。自噬在心肌缺血時被誘發(fā)，再灌注期得到進一步加強。雖然缺血誘發(fā)的自噬對心肌有一定保護作用，但在再灌注階段自噬的進一步加強則可能會誘導細胞死亡，過低或過高的自噬均會加重心肌損傷。心肌缺血/再灌注時LC3-Ⅱ水平上升，自噬發(fā)生。與模型組相比，BCF在缺血及再灌注期均下調LC3-Ⅱ蛋白表達，但相對于自噬抑制劑3-MA而言，BCF在缺血期上調LC3-Ⅱ表達，說明其可誘發(fā)缺血期自噬產(chǎn)生；在再灌注期，BCF下調LC3-Ⅱ表達，說明其抑制了自噬的過度表達而產(chǎn)生抗MIRI作用。

Beclin-1是調節(jié)細胞自噬過程的關鍵基因，Beclin-1介導的自噬/凋亡互反饋信號通路是經(jīng)典的自噬信號途徑之一[12]，而Beclin-1 / Bcl-2 的平衡狀態(tài)則是調控自噬/凋亡互反饋作用的關鍵因素：Bcl-2可負性調節(jié)Beclin-1的致自噬作用，Bcl-2表達下調不僅可誘發(fā)凋亡還能通過激動Beclin-1來激活自噬，導致細胞死亡[2]。我們的前期實驗表明，BCF通過上調Bcl-2蛋白表達而抑制細胞凋亡[6]，本研究結果顯示：與模型組相比，BCF在缺血及再灌注期均下調Beclin-1蛋白表達(P<0.05)，但相對于自噬抑制劑3-MA而言，BCF上調缺血期Beclin-1表達(P<0.05)，可能通過Beclin-1介導的自噬/凋亡互反饋信號通路誘導缺血期自噬的產(chǎn)生；在再灌注期，Beclin-1蛋白表達隨著時間的延長而增高，BCF通過下調Beclin-1蛋白表達，抑制細胞自噬的過度發(fā)生而減輕心肌損傷。因此，BCF對心肌損傷的保護作用可能與其調控缺血/再灌注不同時段Beclin-1蛋白的表達，進而影響B(tài)eclin-1介導的自噬/凋亡互反饋機制有關。

mTOR[13-14]是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬PIK3蛋白激酶類家族，在細胞生長、分化以及增殖等基本功能過程中起著中心調節(jié)的作用。mTOR與自噬的互反饋調控作用是促進細胞存活的重要機制。在自噬初期(缺血期)，mTOR通過對自噬的負調控作用誘導自噬產(chǎn)生，促進細胞存活。Fig 2顯示在缺血期，與模型組相比，BCF上調mTOR表達(P<0.05)，但相對于自噬抑制劑3-MA而言，BCF下調mTOR的表達(P<0.05)；在再灌注期，BCF上調mTOR，并可能通過mTOR的負反饋調節(jié)作用抑制自噬，進而防止自噬過度發(fā)生，保護受損心肌。有意思的是，與3-MA相比，在MIRI的不同時段，BCF始終下調mTOR的蛋白表達，這提示在缺血期，BCF影響自噬，進而產(chǎn)生抗心肌損傷作用可能并非通過mTOR與自噬互反饋途徑，而是通過Beclin-1介導的自噬/凋亡互反饋信號通路；在再灌注期，BCF則通過上調mTOR表達、下調Beclin-1表達，同時影響mTOR介導的自噬/mTOR互反饋信號通路和Beclin-1介導的自噬/凋亡互反饋信號通路，抑制自噬的過度表達，抗MIRI損傷。

綜上所述，BCF可能通過缺血期誘導自噬發(fā)生，而再灌注期抑制自噬過表達，從而發(fā)揮抗心肌缺血/再灌注損傷作用，其詳細機制還有待進一步研究。

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網(wǎng)絡出版時間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.017.html

Effects ofBauhiniachampioniiflavones on adjusting

autophagy against myocardial ischemia/reperfusion injury

SUN Yao, ZHANG Chan, JIAN Jie

(CollegeofPharmacy,GuilinMedicalUniversity,GuilinGuangxi541004,China)

Abstract:AimTo study the effects of Bauhinia championii flavones(BCF) on adjusting autophagy against myocardial ischemia reperfusion injury. Methods120 SD rats were randomly divided into control, model, 3-MA (15 mg·kg-1) and BCF (10, 20 mg·kg-1) groups (n=8). 30min. ischemia, ischemia/reperfusion 1h.or 3h, while myocardial ischemia reperfusion model was established by ligating left anterior descending coronary artery. The contents of creatine kinase-MB (CK-MB), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and total antioxidative capacity (T-AOC) in serum were determined according to the ultraviolet spectrophotometer colorimetric method. The protein expression of LC3-Ⅱ, Beclin-1 and mTOR was observed by Western blot. ResultsCompared with model group, BCF dose-dependently improved T-AOC, decreased CK-MB and iNOS (P<0.05). Meanwhile, BCF down-regulated the protein expression of LC3-Ⅱand Beclin-1, and up-regulated mTOR protein expression (P<0.05). Compared with 3-MA group, BCF reduced the contents of CK-MB and iNOS, increased the level of T-AOC. It raised LC3-Ⅱand Beclin-1 protein expression at 30min. of ischemia, and then declined the protein expression of LC3-Ⅱand Beclin-1. BCF descended the protein expression of mTOR all over the time (P<0.05). ConclusionAutophagy occurs in ischemia then improves in ischemia/reperfusion period. BCF could promote the occurring of autophagy at 30min. of ischemia in the short term and inhibit the excessive expression of autophagy with the increase of time in reperfusion period. BCF pretreatment reduce myocardial ischemia/reperfusion injury may by promoting the occurrence of autophagy during ischemia period and inhibit them in reperfusion.

Key words:BCF; regulation; autophagy; different periods; ischemia reperfusion injury; myocardial protection

通訊作者簡潔(1972-)，女，博士，教授，研究方向：天然藥物成分分離及心血管藥理學，，Tel:0773-2295141，E-mail: jianjielucky@aliyun.com

作者簡介：孫瑤(1989-)，女，碩士生，研究方向：天然藥物成分分離及心血管藥理學，E-mail：350911315@qq.com；

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81360041)；廣西自然科學基金資助項目(No 2012GXNSFAA053148)

收稿日期:2014-09-22,修回日期:2014-10-27

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0232-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.017