曹林峰，趙　卉，秦厚應(yīng)，張　程，徐德祥

(1．安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 合肥　230601；2．安徽醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生毒理學(xué)系，安徽 合肥　230032)

褪黑素減輕博來(lái)霉素誘發(fā)小鼠肺纖維化早期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)

曹林峰1，趙卉1，秦厚應(yīng)1，張程2，徐德祥2

(1．安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 合肥230601；2．安徽醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生毒理學(xué)系，安徽 合肥230032)

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：R-332；R329.24；R563.13；R977.1

摘要：目的探討褪黑素(MT)是否能減輕由博來(lái)霉素(BLM)誘發(fā)小鼠肺纖維化早期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。方法將成年健康♂ ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、MT組、BLM組和MT+BLM組。MT組小鼠給予生理鹽水前30 min經(jīng)腹腔注射MT(10 mg·kg-1)，并在給予生理鹽水后按每24 h一次經(jīng)腹腔注射MT(10 mg·kg-1)，BLM組小鼠經(jīng)氣管插管單次給予BLM(5 mg·kg-1)，MT+BLM組小鼠在給予BLM(5 mg·kg-1)前30min經(jīng)腹腔注射給予MT(10 mg·kg-1)，并在給予BLM后按每24 h一次經(jīng)腹腔注射給予MT(10 mg·kg-1)，對(duì)照組小鼠經(jīng)氣管插管給予等容積的生理鹽水。各組分別在BLM處理后不同時(shí)間點(diǎn)(24、72 h)剖殺小鼠并取材，肺組織進(jìn)行病理切片，HE染色法觀察肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、p-eIF2α和p-IRE1α)的表達(dá)水平，免疫組化檢測(cè)ER應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、p-IRE1α、ATF6α和p-PERK)的分布。結(jié)果成功構(gòu)建了小鼠肺纖維化急性炎癥模型；在BLM處理后，肺重、肺重比和肺炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，并呈明顯時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；MT可明顯降低BLM引起的肺重和肺重比增加，減輕肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；Western blot顯示，MT處理后明顯對(duì)抗BLM引起的ER應(yīng)激敏感蛋白GRP78蛋白的上調(diào)，抑制BLM引起的UPR通路相關(guān)蛋白eIF2α和IRE1α磷酸化；免疫組化結(jié)果顯示，MT可降低BLM誘導(dǎo)的ER應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-IRE1α、ATF6α和p-PERK的表達(dá)。結(jié)論MT可減輕BLM誘發(fā)的小鼠肺纖維化早期ER應(yīng)激反應(yīng)。

關(guān)鍵詞:褪黑素；博來(lái)霉素；炎癥；肺纖維化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；GRP78蛋白

特發(fā)性肺纖維化是一種致命性的肺部疾病，其進(jìn)展緩慢、預(yù)后差。診斷后平均生存期為3年，目前臨床上藥物治療效果不佳，其發(fā)病機(jī)制仍不明確[1]。目前，對(duì)于肺纖維化的研究主要集中于采用博來(lái)霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型[2]，通過(guò)對(duì)該模型的研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激[3]、炎癥反應(yīng)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)[4-5]等有關(guān)。最近的研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)也參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[6,7]。

褪黑素(melatonin，MT)是脊椎動(dòng)物松果體產(chǎn)生和釋放的一種神經(jīng)激素，MT通過(guò)抗氧化及抗炎作用對(duì)BLM誘導(dǎo)的小鼠慢性肺纖維化起保護(hù)作用[8]。最近的研究表明，MT對(duì)BLM誘導(dǎo)的小鼠慢性肺纖維化的保護(hù)可能通過(guò)抑制ER stress反應(yīng)起作用[9]。另一方面，肺纖維化的形成需經(jīng)歷炎癥期、纖維化形成期、纖維化進(jìn)展期等階段[10]，其中，早期炎癥對(duì)慢性纖維化的形成起關(guān)鍵作用。而ER 是維持細(xì)胞生存和正常功能所必需的一種重要細(xì)胞器，在受到外界化學(xué)等刺激后可以通過(guò)ER stress引起炎癥反應(yīng)[7]，但在BLM誘發(fā)小鼠肺纖維化早期，MT是否影響ER stress反應(yīng)尚不清楚。本研究在BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化早期炎癥的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了MT對(duì)BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化早期的保護(hù)作用是否影響ER stress反應(yīng)。

1材料與方法

1.1主要試劑 MT購(gòu)于美國(guó)Sigma化學(xué)試劑公司(批號(hào)：SLBC7539V)；BLM購(gòu)于日本化藥株式會(huì)社(批號(hào)：430312)；GRP78(批號(hào)：3177S)、p-PERK(批號(hào)：3719S)、p-eIF2α(批號(hào)：9721S)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal公司；ATF6α(批號(hào)：A2811)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；β-actin(批號(hào)：BM0627)抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；p-IRE1α(批號(hào)：16927)和ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientifis公司(批號(hào)：LB141873)；SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司(批號(hào)：13152)； DAB購(gòu)自Sigma公司；無(wú)水乙醇(純度>99.7%)購(gòu)于上海振企化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均購(gòu)自Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂ ICR小鼠,6~8周齡，(30±2) g，清潔級(jí),購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周(自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料、水，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律，溫度20℃~25℃，相對(duì)濕度(50±5)%。

1.3動(dòng)物分組和處理36只♂ ICR成年健康小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、MT組各6只，BLM組和MT+BLM組各12只。BLM組小鼠采用腹腔給予10%水合氯醛麻醉(3 ml·kg-1)，約10 min后小鼠完全麻醉，予以微量注射器行氣管插管滴注單次給予BLM(5 mg·kg-1)，立即將小鼠直立沿順時(shí)針及逆時(shí)針各旋轉(zhuǎn)1 min，使藥物均勻分布；Control組小鼠經(jīng)氣管插管給予等容積的生理鹽水；MT+BLM組小鼠在給予BLM(5 mg·kg-1)前30 min和給予BLM后按每24 h一次經(jīng)腹腔注射給予MT(10 mg·kg-1)，MT組小鼠在給予生理鹽水前30 min和給予生理鹽水后按每24 h一次經(jīng)腹腔注射MT(10 mg·kg-1)。分別在BLM處理后不同時(shí)間點(diǎn)(24、72 h)剖殺小鼠并取材，稱(chēng)量肺臟重量，取部分肺臟組織放入4%多聚甲醛溶液固定，其余肺臟組織放入-80 ℃冰箱中保存。

1.4HE染色肺臟組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后，石蠟包埋，切片，常規(guī)石蠟切片，酒精梯度脫蠟至水化，蘇木精染色3 min，流水沖洗10 min，伊紅染色2 min，流水沖去浮色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。同時(shí)，每張病理切片分別進(jìn)行病理評(píng)分，定義0為正常肺組織，1、2、3、4和5分別表示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的范圍百分比分別為10%、10%~30%、30%~80%和80%以上。

1.5Western blot取一定量的肺臟組織，加入組織裂解液制備成20%的組織勻漿液，離心、取上清、定量、蛋白變性。總蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂牛奶溶液封閉后，分別用GRP78、p-eIF2α或p-IRE1α等一抗室溫孵育3 h，DPBST浸洗液浸洗3次(每次10 min)，用DPBS洗一次(10 min)，用對(duì)應(yīng)的IgG二抗(羊抗鼠或羊抗兔)孵育2 h，DPBST浸洗液浸洗3次(每次10 min)，用DPBS洗一次(10 min)，再用ECL發(fā)光液孵育5 min，于自動(dòng)成像儀曝光攝片。運(yùn)用Carestream Molecular Imaging (MI) Software圖像分析軟件測(cè)定各蛋白條帶的灰度值。

1.6免疫組織化學(xué)染色肺臟組織的常規(guī)石蠟切片經(jīng)酒精梯度脫蠟至水化，于切片上滴加0.3%過(guò)氧化氫，室溫下10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，檸檬酸鈉緩沖液微波中高火修復(fù)抗原2次，每次5 min，用5%的羊血清來(lái)封閉非特異性蛋白，37℃恒溫30 min；分別用GRP78、p-IRE1α、ATF6α或p-PERK一抗孵育，37℃恒溫30 min，再置4℃冰箱過(guò)夜；相應(yīng)二抗孵育，37℃恒溫30 min；再進(jìn)行SP反應(yīng)，DAB顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水、透明、封片。在光學(xué)顯微鏡(×100)觀察各內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白分布情況。

2結(jié)果

2.1MT對(duì)BLM所致小鼠肺纖維化早期肺損傷的生理指標(biāo)影響 與Control組相比，小鼠給予BLM處理后24 h與72 h的肺重和肺重比明顯增加(Tab 1，P<0.05)，而72 h較24 h肺重增加更為明顯。與單純BLM處理后24 h相比，MT+BLM處理后24 h的肺重及肺重比有所減低，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與BLM處理后72 h相比，MT+BLM處理后72 h肺重及肺重比有所降低(Tab 1，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2MT對(duì)BLM所致小鼠肺纖維化早期肺損傷的病理影響肺組織HE染色顯示，給予BLM處理24 h與72 h后，肺泡內(nèi)出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但肺間質(zhì)及肺泡壁未見(jiàn)明顯破壞(Fig 1A)。與Control組相比，BLM處理72 h和24 h后，HE染色肺病理評(píng)分有明顯提高(P<0.05)，并且72 h炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及病理評(píng)分都較24 h更為明顯(Fig 1B)。如Fig 1A所示，與單純BLM處理后24 h相比，MT+BLM處理后24 h的小鼠肺炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減輕，并且MT+BLM處理后72 h比BLM處理后72 h減輕明顯。如Fig 1B所示，與BLM處理后72 h相比，MT+BLM處理后72 h的HE染色病理評(píng)分明顯降低(P<0.05)。

GroupControlMTBLM24h72hMT+BLM24h72hLungweight/g0.189±0.0070.186±0.0110.214±0.011*0.230±0.007*0.205±0.0100.209±0.014#Lungweightratio/%0.598±0.0130.598±0.0200.704±0.027*0.755±0.038*0.654±0.9400.662±0.045#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBLM 72 h.

±s, n=6)

1:Control; 2:MT; 3:BLM 24 h; 4: MT+BLM 24 h; 5:BLM 72 h; 6:MT+BLM 72 h

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsBLM in each group.

2.3Western blot檢測(cè)MT對(duì)BLM所致小鼠肺纖維化早期的ER stress相關(guān)蛋白的影響給予BLM 72 h后小鼠肺組織中GRP78的表達(dá)較Control組明顯升高(Fig 2A，P<0.05)，并且eIF2α和IRE1α磷酸化水平在BLM處理72 h后較Control組明顯增加。而與單純BLM處理后72 h比較，MT+BLM處理后72 h小鼠肺組織中GRP78的表達(dá)明顯降低(Fig 2，P<0.05)。同樣，與BLM處理后72 h相比，MT+BLM處理后72 h小鼠肺組織中IRE1α和eIF2α的磷酸化水平明顯降低(Fig 2，P<0.05)。

2.4免疫組化檢測(cè)MT對(duì)BLM所致小鼠肺纖維化早期的ER stress相關(guān)蛋白的影響如Fig 3所示，與Control組比較，BLM處理后小鼠肺組織GRP78、p-IRE1α、ATF6α和p-PERK的免疫組化結(jié)果中DAB顯色陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增加。與單純BLM處理后72 h比較，MT+BLM處理后72 h小鼠肺組織GRP78、p-IRE1α、ATF6α和p-PERK的免疫組化結(jié)果中DAB顯色陽(yáng)性的細(xì)胞明顯減少。

3討論

BLM誘發(fā)的小鼠肺纖維化模型經(jīng)歷炎性期、纖維化形成期、纖維化進(jìn)展期。本研究以炎性期為研究基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)在肺纖維化炎癥期，小鼠肺重及肺重比明顯升高，同時(shí)肺組織HE染色可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而肺間質(zhì)及肺泡壁未見(jiàn)明顯破壞，同時(shí)病理評(píng)分結(jié)果與HE染色結(jié)果一致，炎性損傷呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。另一方面，我們的研究結(jié)果顯示，與BLM組的小鼠相比，給予MT干預(yù)的小鼠肺組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少，且病理評(píng)分也明顯降低，這與Kim等[11]報(bào)道的MT對(duì)肺纖維化保護(hù)機(jī)制與抗炎作用有關(guān)相一致。這些結(jié)果都表明炎癥在BLM誘發(fā)的小鼠肺纖維化的形成過(guò)程中起著重要的作用。

A: GRP78 in the lungs was detected by immunoblots; B: p-eIF2α in the lungs was detected using immunoblots; C: p-IRE1α in the lungs was detected by immunoblots.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBLM 72 h group.

Fig 3　Effects of melatonin on BLM-induced ER stress determined by immunohistochemistry at 72 h (×100)

最近的研究表明，ER stress 反應(yīng)在炎癥發(fā)生過(guò)程中起重要作用[7,12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核生物的一個(gè)細(xì)胞器，它在蛋白質(zhì)的折疊、脂類(lèi)合成、糖原的合成和儲(chǔ)存以及鈣的代謝等方面起決定性的作用[13]。各種生理和病理刺激，如化學(xué)損傷、DNA損傷，缺氧、氧化應(yīng)激和營(yíng)養(yǎng)缺乏，都會(huì)干擾ER的功能，繼而導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)在ER腔內(nèi)大量堆積，從而導(dǎo)致ER stress。ER stress激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，UPR分別通過(guò)激活蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇蛋白酶1(IRE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)三條通路減少蛋白的合成、加快正常蛋白的折疊以及異常蛋白的降解，若UPR失代償則產(chǎn)生細(xì)胞損傷[14]。ER stress可以通過(guò)激活A(yù)TF6、PERK和IRE1三條通路引起炎癥反應(yīng)、EMT及異常修復(fù)機(jī)制而引起肺纖維化[13-14]。為進(jìn)一步明確MT保護(hù)機(jī)制是否涉及ER stress，我們使用Western blot及免疫組化檢測(cè)BLM處理后72 h ER stress相關(guān)蛋白表達(dá)情況。ER分子伴侶GRP78與ER stress的UPR的三個(gè)跨膜蛋白ATF6、PERK和IRE1相結(jié)合，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，該蛋白與跨膜蛋白解離，激活UPR三條通路，在UPR反應(yīng)后其本身表達(dá)可被上調(diào)，是ER stress的敏感蛋白。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予BLM處理后GRP78表達(dá)升高，而給予MT處理后明顯降低了BLM對(duì)GRP78的上調(diào)作用?？缒さ鞍譖ERK在ER stress反應(yīng)時(shí)通過(guò)磷酸化方式激活，使下游eIF2α磷酸化，繼而激活核因子κB(NK-κB)引起炎癥反應(yīng)，我們通過(guò)檢測(cè)p-PERK發(fā)現(xiàn)，MT可以明顯抑制BLM誘導(dǎo)的PERK磷酸化水平與分布范圍。IRE1α可通過(guò)磷酸化激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路引起炎癥反應(yīng)，我們的研究也發(fā)現(xiàn)，給予MT后可明顯抑制BLM誘導(dǎo)的IRE1α磷酸化水平與分布范圍。ATF6激活后可通過(guò)p38引起炎癥反應(yīng)，我們觀察了ATF6分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予MT后，ATF6α分布較單純BLM分布減少。我們的以上研究結(jié)果表明，在BLM所致小鼠肺纖維化早期MT明顯抑制了ER stress反應(yīng)的三條通路[13]。

ER stress 激活UPR通路后可分別通過(guò)三條通路，引起炎癥反應(yīng)[5]， ER stress也可引起氧化應(yīng)激，同時(shí)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)又能進(jìn)一步加重ER stress[15]。文獻(xiàn)報(bào)道[16]MT對(duì)肺纖維化形成的保護(hù)機(jī)制可能與其有抗氧化應(yīng)激及抗炎癥作用都有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MT對(duì)BLM所致的小鼠早期損傷的保護(hù)作用可能與抑制ER stress有關(guān)，但MT是直接通過(guò)影響ER stress相關(guān)蛋白，還是通過(guò)影響氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)繼而間接影響ER stress相關(guān)蛋白，抑或通過(guò)ER stress、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激三種機(jī)制共同起保護(hù)作用，在本研究中并沒(méi)有完全闡明，有待進(jìn)一步研究。因此，根據(jù)本研究結(jié)果可得出的結(jié)論是MT能減輕BLM引起小鼠肺纖維化早期的損傷并抑制ER stress。總之，本研究闡明了MT對(duì)肺纖維化早期炎癥期的保護(hù)作用及其部分機(jī)制，為應(yīng)用于臨床治療提供了新的證據(jù)。

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.016.html

Melatonin alleviates endoplasmic reticulum stress at an early stage

during bleomycin-induced lung fibrosis in mice

CAO Lin-feng1, ZHAO Hui1, QIN Hou-ying1, ZHANG Cheng2, XU De-xiang2

(1.DeptofRespiratory,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China;

2.DeptofToxicology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:AimTo investigate whether melatonin (MT) can alleviate endoplasmic reticulum(ER) stress at an early stage of bleomycin(BLM)-induced lung fibrosis in mice. MethodsAdult healthy male ICR mice were divided randomly into control group, MT group, BLM group and MT+BLM group. In MT group, mice had saline treatment 30 minutes after having the intraperitoneal injection of MT (10 mg·kg-1) and had been intraperitoneally injected with MT once in the following every 24 hours. In BLM group, mice were intratracheally injected with a single dose of BLM (5 mg·kg-1). In MT+BLM group, mice had been intraperitoneally injected with BLM 30 minutes after having MT and had been injected with MT once in the following every 24 hours. In control group, mice received the same level of saline treatment in the same manner. All mice were dissected for collecting the tissue of lungs at different time points (24h, 72h) after BLM treatment. Inflammatory cell infiltration of lungs was determined by HE staining. The level of ER stress related proteins (GRP78, p-eIF2α, p-IRE1α) in lungs was determined using Western blot. The distribution of ER stress related proteins (GRP78, p-IRE1α, ATF6α, p-PERK) in lungs was detected by immunohistochemistry. ResultsThe model of BLM-induced acute inflammation of lung fibrosis in mice had been successfully constructed. After BLM treatment, lung weight, lung weight ratio and inflammatory cell infiltra tion were significantly increased with a significant correlation between time and effectiveness. After MT treatment, lung weight, lung weight ratio and inflammatory cell infiltration were significantly reduced. The results of Western blot showed that MT pretreatment not only prevented the increase of BLM-induced GRP78 protein significantly, but also restrained the phosphorylation of eIF2α and IRE1α in mouse lungs. Immunohistochemistry also showed that MT pretreatment reduced the expression of GRP78, p-IRE1α, ATF6α and p-PERK. ConclusionMT alleviates ER stress effectively at an early stage of BLM-induced lung fibrosis in mice.

Key words:melatonin; bleomycin; inflammation; lung fibrosis; ER stress; GRP78 protein

通訊作者趙卉(1967-)，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：肺纖維化，，Tel：0551-63869557， E-mail：zhaohuichenxi@126.com

作者簡(jiǎn)介：曹林峰(1988-)，男，碩士生，研究方向：肺纖維化，E-mail：88341446@qq.com；

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No 30973544)

收稿日期:2014-10-23,修回日期:2014-11-21

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2015)02-0227-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.016