王闖 王紹欣 董平栓 汪硯雨 王可 李轉(zhuǎn)珍 魏麗娟 陳士芳 孟雅麗閆鵬 劉向勇 程建新 王麗平 段娜娜

基礎(chǔ)研究

中華小豬急性心肌梗死心肌病理觀察

王闖 王紹欣 董平栓 汪硯雨 王可 李轉(zhuǎn)珍 魏麗娟 陳士芳 孟雅麗閆鵬 劉向勇 程建新 王麗平 段娜娜

目的 探討腫瘤壞死因子-alpha（TNF-α）在中華小豬急性心肌梗死（AMI）梗死心肌中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，為AMI血運(yùn)重建及心肌梗死后干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 7頭實(shí)驗(yàn)性中華小豬全麻后Seldinger法穿刺右側(cè)股動(dòng)脈，行冠脈造影后經(jīng)微導(dǎo)管注入明膠海綿封堵鈍緣支（OM支），建立AMI模型后，分別取第1、3、5、7、10、14、17天行免疫組化檢測(cè)心肌組織中TNF-α表達(dá)情況。結(jié)果 免疫組化顯示，正常豬心肌未見TNF-α表達(dá)。AMI后第3天壞死心肌中開始出現(xiàn)TNF-α表達(dá)，第5、7天表達(dá)逐漸升高，第10天達(dá)高峰，第14天開始下降,第17天進(jìn)一步下降。結(jié)論 冠脈造影顯示，明膠海綿封堵OM支后其遠(yuǎn)端血流消失，AMI模型成功建立。AMI后第10天壞死心肌中TNF-α表達(dá)最為明顯，與壞死心肌的炎癥及修復(fù)過程密切相關(guān)。

急性心肌梗死； 腫瘤壞死因子-alpha； 中華小豬； 動(dòng)物模型

急性心肌梗死（AMI）是一種發(fā)病迅速、死亡率和致殘率極高的心臟疾病，其發(fā)病與劇烈的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。腫瘤壞死因子-alpha（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，但AMI后梗死心肌局部TNF-α的表達(dá)情況與炎癥和心肌修復(fù)的關(guān)系目前國內(nèi)外尚未達(dá)成共識(shí)。通過建立AMI動(dòng)物模型，觀察AMI后不同時(shí)期TNF-α的動(dòng)態(tài)變化，有可能為解決此問題提供實(shí)驗(yàn)參考。中華小豬因其心臟在解剖結(jié)構(gòu)、心臟血管分布等方面與人類相似，封堵其冠脈造成的缺血性心臟病發(fā)病過程與人類高度相似，一直是人類心血管疾病模型制備的優(yōu)選動(dòng)物。研究顯示，AMI后梗死心肌周圍會(huì)發(fā)生劇烈的炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)的程度會(huì)影響心肌的修復(fù)過程，對(duì)患者預(yù)后至關(guān)重要。TNF-α是一個(gè)多向性的細(xì)胞因子，對(duì)心肌缺血極度敏感，可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的存活和凋亡，觸發(fā)其他細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。傳統(tǒng)的研究方法以抽血觀察TNF-α的動(dòng)態(tài)變化居多，對(duì)于動(dòng)態(tài)觀察梗死心肌中TNF-α的變化過程鮮有報(bào)道。本研究使用明膠海綿封堵鈍緣支建立中華小豬AMI模型，直觀、連續(xù)、動(dòng)態(tài)地觀察AMI后梗死心肌中TNF-α的表達(dá)情況，探討AMI后TNF-α的干預(yù)治療與TNF-α在梗死心肌中表達(dá)情況的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 中華小豬由泰州泰和生物技術(shù)有限公司提供，8只，體重13～18 kg，全部經(jīng)防疫檢驗(yàn)合格，檢疫證號(hào)3205197447，許可證號(hào)SCXK（蘇）2011-0002。同種同窩雄性。排除體質(zhì)不良、進(jìn)食不佳、近期患病的豬。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 ⑴麻醉藥品：地西泮注射液（哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司）、氯胺酮（江蘇恒潤醫(yī)藥股份有限公司）、利多卡因（江蘇藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司）。⑵造影劑：碘普羅胺（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）。⑶HE染色試劑：二甲苯（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）、無水乙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）、甲醛（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）、TNF-α檢測(cè)試劑盒（美國ABCAM公司，貨號(hào)AB1793）。⑷血管封堵材料：明膠海綿（廣州市彥達(dá)貿(mào)易有限公司）。⑸除顫儀（日本光電工業(yè)株式會(huì)社TEC-5521C）。⑹數(shù)字減影血管造影即DSA（PHLIPSMML19）。⑺心電監(jiān)護(hù)儀（Philips Medizin Systeme Boebligen Gmbh German M8001A)。⑻吸痰機(jī)（魚躍醫(yī)療TE-A）。⑼電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司202-1型）、載玻片（海倫 規(guī)格：25.0 mm×7.5 mm 厚度：1～1.2 mm）及蓋玻片（鹽城市信泰醫(yī)療器械廠0.13～0.17 mm）。⑽包埋機(jī)（LEIKE湖北襄樊徠克電子儀器廠PPDB/21）。⑾冷臺(tái)機(jī)（LEIKE湖北襄樊徠克電子儀器廠PPDB/21）及切片機(jī)（LEICA RM2235）。⑿數(shù)碼電子顯微鏡（NIKON ECLIPSE 80i）。⒀造影介入材料：6F動(dòng)脈鞘管、6FJR、微導(dǎo)管、指引導(dǎo)絲、J型導(dǎo)絲等（臨床使用過的廢舊材料，均經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒）。⒁備用藥品：肝素（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司）、腎上腺素（天津藥業(yè)集團(tuán)）、多巴胺（上海禾豐制藥有限公司）、尼可剎米（天津藥業(yè)集團(tuán)）、阿托品（福仁藥業(yè)集團(tuán)信陽有限公司）、氯化鉀（北京益民藥業(yè)有限公司）、硝酸甘油（北京益民藥業(yè)有限公司）、地塞米松針（開封制藥有限公司）等。

1.3 AMI模型建立方法 小豬禁食12 h，禁水8 h，肌內(nèi)注射氯胺酮10 mg/kg誘導(dǎo)麻醉。將實(shí)驗(yàn)豬清洗干凈后四肢固定于特定木板上，然后放置于導(dǎo)管床上，以3 L/min流量給氧，胸部及四肢備皮，心電持續(xù)監(jiān)護(hù)，用套管針于耳緣大靜脈建立靜脈通道，靜脈緩慢推注1 ml安定及10 mg氯胺酮。術(shù)中小豬一直保持麻醉狀態(tài)，除顫儀及吸痰機(jī)備用。

采用Seldinger法穿刺右股動(dòng)脈建立動(dòng)物模型。具體步驟：①碘伏常規(guī)消毒，鋪無菌巾。②觸及右側(cè)股動(dòng)脈搏動(dòng)最強(qiáng)處，利多卡因局部麻醉，穿刺成功后可見鮮紅色動(dòng)脈血自針尾噴出，送入導(dǎo)引導(dǎo)絲，沿引導(dǎo)絲送入6 F動(dòng)脈鞘管，隨即彈丸式注入肝素1000 U。術(shù)中每30 min可追加肝素2000 U。③在J型導(dǎo)絲引導(dǎo)下將Guiding導(dǎo)管送入升主動(dòng)脈根部，行左右冠狀動(dòng)脈多體位造影。心電監(jiān)護(hù)示：竇性心律，160～200 次/min，血壓 160/130 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。將Runthrough遠(yuǎn)端，微導(dǎo)管送入OM支近端，撤出導(dǎo)絲，將明膠海綿混懸液（明膠海綿溶于造影劑碘普羅胺內(nèi)）經(jīng)微導(dǎo)管推入，造影顯示OM支遠(yuǎn)端血流消失，撤出微導(dǎo)管，監(jiān)測(cè)各項(xiàng)生命體征及氧飽和度。④術(shù)畢，拔出6 F動(dòng)脈鞘管，置入人用鎖骨下靜脈套管，封閉股動(dòng)脈創(chuàng)口，肝素封管后，將其固定于術(shù)區(qū)，貼膜覆蓋。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將動(dòng)物送回飼養(yǎng)中心，單豬飼養(yǎng)，避免感染。

1.4 梗死心肌病理切片的制作 分別取AMI后第 1、3、5、7、10、14、17 天小豬和對(duì)照豬整體心臟，經(jīng)4%的甲醛固定后于左室側(cè)壁分別切取4塊梗死心肌及1塊正常心肌，脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，行TNF-α免疫組化檢測(cè)。TNF-α免疫組化檢測(cè)一抗為小鼠抗豬單克隆抗體，二抗為通用型二抗兔抗鼠免疫組化試劑盒。①3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。③蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min×3次，檸檬酸加熱抗原修復(fù)。③10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min，棄去血清；滴加一抗工作液（稀釋1∶200），37℃孵育，4℃過夜。④PBS沖洗5 min×3次。⑤滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育15 min。⑥PBS沖洗5 min×3次。⑦滴加適量的堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min。⑧PBS沖洗5 min×3次。⑨顯色劑顯色（DAB顯色）6 min。⑩自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片，于40×倍電子數(shù)碼顯微鏡下觀察并攝片。

1.5 主要觀察指標(biāo) AMI后不同天數(shù)梗死心肌中TNF-α的動(dòng)態(tài)變化。

1.6 設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者 實(shí)驗(yàn)由通訊作者設(shè)計(jì)，實(shí)施由第一作者及其他作者負(fù)責(zé)，評(píng)估由河南科技大學(xué)一附院病理科、河南科技大學(xué)新區(qū)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室及河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物教研室負(fù)責(zé)。

2 結(jié)果

2.1 中華小豬AMI前后冠脈造影情況 7頭中華小豬均成功進(jìn)行了冠脈造影術(shù)及明膠海綿封堵術(shù)。中華小豬冠脈走形與人類冠脈類似，明膠海綿封堵OM支后顯示遠(yuǎn)端血流消失，AMI模型成功建立。見圖1。

2.2 TNF-α的表達(dá)情況 為研究AMI后不同時(shí)期梗死心肌中TNF-α的表達(dá)情況，對(duì)中華小豬AMI后第 1、3、5、7、10、14 天的梗死心肌（圖 2）免疫組化檢測(cè)顯示：正常未梗死心肌中未見TNF-α的表達(dá)（圖2A）；AMI后第1天梗死心肌中幾乎未見TNF-α的表達(dá)（圖2B）；梗死后第3天開始出現(xiàn)TNF-α的表達(dá)（圖2C）；梗死后第5、7天TNF-α的表達(dá)繼續(xù)增加（圖2D、E），于第10天達(dá)高峰（圖2F）；梗死后第 14、17天逐漸下降（圖 2G、H）。

3 討論

TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，屬于腫瘤壞死因子及其受體（tumor necrosis factor/receptor，TNF/TNFR）超家族的一員，與一些病理過程如急性炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病等密切相關(guān)。炎癥反應(yīng)在AMI中發(fā)揮關(guān)鍵作用，血液和心肌中TNF-α升高見于心肌梗死等疾病中。而TNF-α是炎癥反應(yīng)強(qiáng)有力的觸發(fā)者，多種類型的細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等均能產(chǎn)生TNF-α。心肌細(xì)胞缺血時(shí)亦能分泌TNF-α[1]，但在心肌損傷后主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌[2]。研究發(fā)現(xiàn)，血液中TNF-α濃度在AMI后1 h顯著升高[3]，于24 h內(nèi)達(dá)高峰[4]，隨后開始下降，7 d后逐漸恢復(fù)正常。

國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，AMI后心肌中TNF-α在梗死后數(shù)天內(nèi)大量增加，引起心肌嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，心肌細(xì)胞凋亡、肥大，心臟重塑，最終導(dǎo)致射血分?jǐn)?shù)減小，梗死面積擴(kuò)大，心肌收縮功能障礙及致命性心律失常和心臟破裂等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥。AMI心肌壞死的發(fā)生發(fā)展與炎癥因子密切相關(guān)。TNF-α在AMI早期血液中即有較高濃度，隨后遷移至心肌高度表達(dá)，對(duì)心肌壞死的進(jìn)展及修復(fù)有重要影響。但動(dòng)態(tài)觀察壞死心肌中TNF-α的表達(dá)，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究系統(tǒng)觀察了AMI后第1、3、5、7、10、14、17 天梗死心肌中 TNF-α 的表達(dá)情況，AMI后第1天梗死心肌中幾乎未見TNF-α的表達(dá)，第3天開始出現(xiàn)TNF-α的表達(dá)，第5、7天繼續(xù)增多，梗死后第10天表達(dá)顯著增強(qiáng)，隨后開始下降。梗死后第5～17天可見大量肉芽組織和纖維瘢痕組織，梗死區(qū)域逐漸被其完全取代，可見許多新生的毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。這充分說明AMI后心肌中的炎癥發(fā)生發(fā)展及動(dòng)態(tài)演變過程，而TNF-α可能起到一定作用。

Sun等[5]通過結(jié)扎實(shí)驗(yàn)鼠左前降支冠狀動(dòng)脈建立心肌梗死模型的研究發(fā)現(xiàn)，梗死心肌局部TNF-α的升高，通過誘發(fā)過度的炎癥反應(yīng)、基質(zhì)和膠原蛋白的降解，提高基質(zhì)金屬蛋白酶的活性和增加細(xì)胞凋亡，促進(jìn)急性心臟破裂和慢性左心室功能障礙。有學(xué)者[6]用TNF-α雜合體轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)鼠培育的表達(dá)TNF-α的后代模型研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠心肌過度表達(dá)的TNF-α引起心室擴(kuò)大、射血分?jǐn)?shù)降低、房性或室性心律失常，并降低實(shí)驗(yàn)鼠的存活率。也有學(xué)者[7]研究發(fā)現(xiàn)，通過堵塞大鼠左前降支冠狀動(dòng)脈血管，30 min內(nèi)即發(fā)現(xiàn)心肌內(nèi)有TNF-α基因和蛋白表達(dá)。以上研究均說明，TNF-α能明顯促進(jìn)心肌壞死的發(fā)生和發(fā)展，延緩心肌的修復(fù)進(jìn)程。

研究已證實(shí)，AMI是一個(gè)急性炎癥過程，那么抑制這種炎癥過程能否減輕心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、促進(jìn)心肌較快修復(fù)，是目前研究的熱點(diǎn)問題，國內(nèi)外研究者正在進(jìn)行一系列的研究和探討。Sugano等[8]通過結(jié)扎雄性大鼠左冠狀動(dòng)脈建立的AMI模型的研究發(fā)現(xiàn)，AMI后早期釋放的TNF-α促進(jìn)心肌損傷和誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，用TNF-α拮抗劑即可溶性TNF-α1型受體（sTNFR1）表達(dá)的質(zhì)粒DNA心肌內(nèi)直接注射治療，可以降低心肌中TNF-α的生物活性和減少心肌細(xì)胞凋亡。Skyschally等[9]通過用豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)注入微滴建立的冠狀動(dòng)脈微栓塞模型發(fā)現(xiàn)，TNF-α不僅能導(dǎo)致心肌舒縮功能障礙，而且延遲對(duì)心肌梗死的保護(hù)作用；用TNF-α抗體冠脈內(nèi)灌注能顯著減小心肌梗死面積。有學(xué)者用狗為載體研究心臟舒縮功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，將含人類活性TNF-α重組體（rhTNF-α）的溶液注入成年雜種狗體內(nèi)，24 h后狗心臟收縮和舒張功能明顯減退[10]。Yokoyama等[11]通過使用成年貓心臟和分離的心肌細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α對(duì)成年貓的心室和分離的心肌細(xì)胞具有負(fù)性肌力作用，而清除TNF-α可以完全逆轉(zhuǎn)這種作用，進(jìn)一步用TNF-α抗體中和治療，可以預(yù)防TNF-α對(duì)分離心肌細(xì)胞的負(fù)性肌力作用。

不同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，清除或中和TNF-α均能顯著減輕心肌壞死，加速修復(fù)過程。TNF-α單克隆抗體治療可顯著縮小心肌梗死面積，減少血液脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，減弱有害的心臟重塑，抑制對(duì)急性損傷失調(diào)的免疫反應(yīng)[12,13]。TNF-α轉(zhuǎn)換酶介導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞中TNF-α的成熟在AMI的不良預(yù)后中發(fā)揮重要作用，而抑制TNF-α轉(zhuǎn)換酶也許是減少AMI后相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的可能靶點(diǎn)[14]。探索性心肌內(nèi)應(yīng)用TNF-α抗體以抑制異常的免疫反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)一系列不利的心臟重塑過程，不失為未來研究的重點(diǎn)。

AMI后抑制TNF-α所誘發(fā)的一系列不利的效應(yīng)可能具有廣闊的研究前景，為未來AMI患者的治療和預(yù)后帶來新的希望。但本研究樣本數(shù)較少，尚需大樣本的研究予以驗(yàn)證。

（本文圖片第863頁）

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Pathological observation of Chinese small porcine AMI

WANG Chuang，WANG Shao-xin，DONG Ping-shuan，et al.Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China

Objective To observe the dynamic expression of tumor necrosis factor alpha（TNF-α）in myocardial tissue in which Chinese small porcine survive different days and to provide experimental basis of revascularization and intervention after AMI.Methods The obtuse marginal（OM）branch of 8 Chinese small porcines were blocked by gelatin sponge via microcatheter under general anesthesia through Seldinger right femoral artery puncture after coronary angiography.After AMI model were established successfully，the animals were sacrificed after 1，3，5，7，10，14，17 days respectively use immunohistochemical staining to test the expression of tumor necrosis factor alpha（TNF-α）in the cardiac muscles.Results Immunohistochemistry showed there was no TNF-α in normal myocardial tissue，TNF-α was started to express in the necrotic myocardial tissue on 3 day after AMI，increased gradually on 5-7 day post-AMI，peaked on 10 day and started to decrease on 14 day，decreased further on 17 day.Conclusion Coronary angiography showed that the remote flow disappeared after the OM branches were blocked by gelatin sponge，the model of AMI was establish successfully.The necrotic myocardial tissue was repaired preliminarily and revascularization was safe relatively.The expression of TNF-α in the necrotic areas peaked on 10 day post-AMI and were associated with the inflammation and reparative processes of the necrotic cardiac muscles.

Acute myocardial infarction； Tumor necrosis factor alpha； Chinese small porcine； The model of animal

WANG Shao-xin，E-mail：WSXdoctor@163.com

洛陽市科技支撐項(xiàng)目資助（項(xiàng)目編號(hào)：1101047A）

471003 河南省洛陽市，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科

王紹欣，E-mail：WSXdoctor@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．09．022

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2016）09-0850-04

2016-03-02）