姜 宇 李福艷 劉沖沖 徐 慧 孫虎山 王 磊①

(1. 魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 煙臺(tái) 264025; 2. 魯東大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 煙臺(tái) 264025)

隨著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的逐步擴(kuò)大及養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化, 水產(chǎn)病害對(duì)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的破壞日趨嚴(yán)重。其中水產(chǎn)病原菌是水產(chǎn)品的主要病害之一, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失, 嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展(黃利強(qiáng)等, 2010; 李晨等,2011)。目前人們對(duì)水產(chǎn)病原菌的防治普遍采用傳統(tǒng)消毒滅菌的方法, 通過大量施用各種消毒劑和抗生素等藥劑來控制病害的傳播蔓延, 但這些藥物大量頻繁的使用容易導(dǎo)致水產(chǎn)品藥物殘留、污染水體環(huán)境并對(duì)人體健康造成危害。另外, 病原菌受抗生素等藥物刺激后會(huì)發(fā)生變異產(chǎn)生耐藥性, 從而使抗菌藥物的殺菌效力下降(黃利強(qiáng)等, 2010)。因此, 研制開發(fā)綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生耐藥性的新型抑菌劑成為目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的重要問題。

人類很早就認(rèn)識(shí)到銀具有廣譜殺菌作用, 并用銀來殺菌消毒(Crabtree et al, 2003)。納米銀(Silver nanoparticles, AgNPs)是采用納米技術(shù)合成的粒徑在1—100 nm的金屬銀單質(zhì), 納米化處理后的抑菌材料,其大的比表面積和小尺寸效應(yīng), 極大提高了對(duì)細(xì)菌表面的吸附性和滲透性, 顯著提高了抗菌效果, 所以它的殺菌作用比普通銀提高了數(shù)百倍。大量研究表明:納米銀具有抗菌譜廣、抗菌性強(qiáng)、生物安全性高、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn), 近年來受到人們的普遍關(guān)注(Kathiresan et al, 2009)。目前, 納米銀已成為一種重要的無機(jī)殺菌劑, 并逐漸實(shí)現(xiàn)了商品化。在傳統(tǒng)的抗菌領(lǐng)域中抗生素等抑菌劑占據(jù)統(tǒng)治地位, 而納米銀作為一種新興的納米抗菌材料異軍突起, 激發(fā)了人們極大的研究興趣, 具有廣闊的應(yīng)用前景(Rai et al, 2009)。

納米銀的制備技術(shù)種類繁多, 采用較多的是化學(xué)法和物理法(Frattini et al, 2005; Chen et al, 2010)。但這些方法或者對(duì)儀器要求高、能源消耗大; 或者尺寸難以控制; 或者在實(shí)驗(yàn)過程中需要添加還原劑、穩(wěn)定劑或分散劑等化學(xué)試劑, 在一定程度上對(duì)環(huán)境和人體健康造成危害。另外, 銀納米粒子極易團(tuán)聚和被氧化, 導(dǎo)致在應(yīng)用時(shí)失去其應(yīng)有的功能, 不利于長期穩(wěn)定使用。因此, 研究和探索新的納米銀制備方法,改善已有納米銀的品質(zhì), 將成為納米銀材料的重要發(fā)展方向。與傳統(tǒng)的合成技術(shù)相比, 納米生物合成技術(shù)在合成過程中利用植物、微生物等生物中的活性物質(zhì)同時(shí)發(fā)揮還原劑和穩(wěn)定劑的雙重作用, 無需添加其它化學(xué)試劑, 一步法即可制備出納米銀材料。生物合成法具有原料價(jià)格低廉易得、反應(yīng)條件溫和可控、合成效率高、環(huán)境友好安全等優(yōu)點(diǎn), 并且該方法適合在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模制備納米銀顆粒(Mude et al, 2009;Lukman et al, 2011)。

山楂(Crataegus pinnatifida Bunge), 為薔薇科山楂屬。其適應(yīng)環(huán)境性強(qiáng), 廣泛分布于亞洲、歐洲、中北美洲及南美洲北部, 是一種重要的植物資源(趙二勞等, 2008)。山楂的果實(shí)營養(yǎng)豐富, 可生吃或作果脯糖點(diǎn), 干制后可入藥, 綜合利用價(jià)值很高。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為山楂具有消食健胃, 行氣散瘀, 化濁降脂的作用, 可用于開胃健脾、消食化滯、降血壓、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、治療心絞痛等(Vierling et al, 2003;Dalli et al, 2008)。山楂中的主要成分是黃酮類化合物,從山楂中分離的黃酮成分有30余種, 包括原花青素、表兒茶酚、槲皮素等, 此外山楂中還含有綠原酸、咖啡酸、山楂酸、果酸、鞣質(zhì)、金絲桃甙、表兒茶酚、膽堿、乙酰膽堿、維生素C、胡蘿卜素等成分, 這些物質(zhì)多具有抗氧化作用, 能減少體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生(Rayyan et al, 2005; 金寧等, 2007)。山楂中這些豐富的還原性物質(zhì)為納米銀的生物合成提供了保障。

目前有關(guān)生物合成納米銀體外抑制臨床病原菌方面的研究報(bào)道很多(Kumar et al, 2014; Sadeghi et al,2015b), 而探討其在水產(chǎn)領(lǐng)域中應(yīng)用的甚少, 以山楂制備納米銀并開展其對(duì)水產(chǎn)病原菌抑菌方面的研究未見報(bào)道。本研究系統(tǒng)比較了以山楂果實(shí)超純水提取物和乙醇提取物所制備的納米銀抑菌材料的理化性質(zhì), 并檢測其對(duì)典型的水產(chǎn)病原菌的抑菌活性, 為新型納米抑菌材料的研制與開發(fā)乃至在水產(chǎn)抑菌領(lǐng)域中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

山楂果實(shí)為市場銷售。

1.2 菌種

實(shí)驗(yàn)中所用供試病原菌菌株大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄桿菌(Staphylococcus aureus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和點(diǎn)狀氣單胞菌(Aeromonas punctata)均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.3 試劑和培養(yǎng)基

硝酸銀(AgNO3)、蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉, 均為分析純, 購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

LB培養(yǎng)基: 胰蛋白胨 10 g, 酵母提取物 5 g,氯化鈉 5 g, 瓊脂粉 15 g, 蒸餾水定容至 1000 mL,1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4; 以上成分不加瓊脂粉配制液體培養(yǎng)基。120°C高壓滅菌20 min。該培養(yǎng)基用于大腸桿菌、金色葡萄球菌等臨床病原菌的培養(yǎng)。

2216E培養(yǎng)基: 蛋白胨5 g, 酵母膏1 g, 磷酸高鐵0.01 g, 瓊脂粉15 g, 陳海水定容至1000 mL, 用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.6—7.8; 以上成分不加瓊脂粉配制液體培養(yǎng)基。120°C高壓滅菌20 min。該培養(yǎng)基用于鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和點(diǎn)狀氣單胞菌等海洋水產(chǎn)病原菌的培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 生物合成納米銀 取新鮮的山楂果實(shí)清洗后切成小塊, 稱取10 g, 分別采用100 mL超純水或者100 mL乙醇為提取液, 80°C加熱回流2 h, 回流結(jié)束后將制得的溶液進(jìn)行抽濾, 得到山楂提取液, 冷卻至室溫后4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

取 18.8 mL超純水, 加入 200 μL 0.1mol/L的AgNO3溶液(終濃度為1 mmol/L), 再加入1 mL上述山楂提取液, 混合后, 94°C水浴加熱回流1 h, 注意觀察溶液顏色的變化, 反應(yīng)結(jié)束即得到生物合成的納米銀, 4°C避光保存。

1.4.2 生物合成納米銀的表征 合成的納米銀顆粒的最大吸收波長采用 UV-255紫外-可見分光光度計(jì)(島津, 日本)檢測, 以山楂提取液為對(duì)照, 掃描波長為 300—700 nm。納米銀顆粒的形態(tài)及粒徑用JEM-1230透射電子顯微鏡(日立, 日本)進(jìn)行表征: 取5 μL樣品滴加在覆炭銅網(wǎng)上, 室溫干燥, 在 100 kV電壓下觀察。X 射線晶體衍射(XRD)分析: 取一定量合成的納米銀, 濃縮后滴到樣品槽內(nèi), 60°C真空干燥1h, 反復(fù)操作5—6次, 在槽內(nèi)形成固體納米銀, 使用X 射線衍射儀(D/max-2500PC, 日本, 理學(xué))進(jìn)行表征,以 Cu Kα 為輻射源, λ = 0.15406 nm, 電壓 40 kV, 電流 200 mA, 掃描范圍 5°—80°。

1.4.3 生物合成納米銀的抑菌活性檢測

(1) 抑菌圈試驗(yàn) 采用杯碟法檢測生物合成納米銀的抗菌活性。將供試病原菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長期(OD600=1.0), 稀釋至 106CFU/mL, 取100 μL均勻涂布于固體培養(yǎng)基上, 在培養(yǎng)基上放置牛津杯(杯外徑8 mm), 然后在杯中加入20 μL生物合成的納米銀溶液, 并用生理鹽水和山楂提取物做陰性對(duì)照, 每種菌做三次重復(fù)。將培養(yǎng)平皿在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察, 分別測量抑菌圈直徑, 取平均值, 判斷合成納米銀材料的抑菌活性。

(2) 抑菌動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 將鰻弧菌在2216E液體培養(yǎng)基中28°C, 150 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長期, 將培養(yǎng)好的菌液稀釋到1×106CFU/mL。分別加入不同量的納米銀材料使終濃度分別為10、20 μg/mL, 以加生理鹽水的菌液為對(duì)照, 28°C恒溫?fù)u床150 r/min培養(yǎng), 每隔0、10、30、60、120、180 min取樣, 用分光光度計(jì)測OD600值, 做供試菌生長動(dòng)力學(xué)曲線。

(3) 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)的測定 選取鰻弧菌作為供試菌, 采用二倍稀釋法測定生物合成納米銀的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC): 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長期的菌懸液稀釋到1×106CFU/mL, 分裝到8個(gè)試管中,每管加1 mL菌液。將生物合成的納米銀溶液(102.8 μg/mL)分別兩倍梯度稀釋成 8個(gè)濃度梯度, 各取1 mL分別加入上述裝有菌液的試管中, 另取兩支試管分別加入2 mL 2216E液體培養(yǎng)液和106CFU/mL的鰻弧菌菌懸液作為陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組。28°C,150 r/min培養(yǎng)24 h, 觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 找到稀釋倍數(shù)最大且澄清的試管, 其所對(duì)應(yīng)的納米銀溶液的濃度即為該活性物質(zhì)的MIC。將上述各澄清試管中的培養(yǎng)物分別涂布于2216E固體培養(yǎng)基平板上, 28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 菌落數(shù)小于5個(gè)的培養(yǎng)平皿所對(duì)應(yīng)的最低納米銀溶液濃度即為該活性物質(zhì)的最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration, MBC)。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物合成納米銀的制備

分別采用山楂的超純水提取物和乙醇提物作為還原劑合成納米銀。隨著反應(yīng)的進(jìn)行, 未與 AgNO3混合的兩種山楂提取液無任何顏色變化, 而加入AgNO3溶液的兩種提取液的顏色均發(fā)生了明顯變化:山楂的超純水提取液由淡紅色變成淺金黃色; 山楂乙醇提取液由淺褐色變成金黃色(圖 1)。這種顏色的改變是由于金屬納米粒子表面等離子體子共振(surface plasmon resonance, SPR)造成的, 金黃色是納米銀水溶液的特征顏色, 而納米銀所呈現(xiàn)的顏色的深淺與其粒徑和濃度有關(guān), 一般粒徑和濃度越大顏色越深(Ashokkumar et al, 2015)。通過顏色的變化初步表明了納米銀粒子的形成, 山楂中所富含的黃酮類化合物、原花青素、綠原酸、果酸、維生素C、胡蘿卜素等還原性物質(zhì)能夠?qū)?Ag+還原成納米銀,山楂的兩種提取液均能用于納米銀的生物合成。我們將山楂的超純水提取物制備的納米銀命名為W-AgNPs; 山楂的乙醇提取物制備的納米銀命名為E-AgNPs。

圖1 山楂提取液及其制備的納米銀溶液的效果圖Fig.1 The photographs of hawthorn fruit extract and synthesized AgNPs

2.2 生物合成納米銀的理化性質(zhì)

2.2.1 紫外-可見(UV-vis)吸收光譜圖 我們進(jìn)一步用UV-vis光譜對(duì)山楂生物合成的納米銀進(jìn)行鑒定。UV-vis光譜是表征銀納米顆粒的重要手段, 典型的銀納米粒子在 400—500 nm范圍內(nèi)由于特征性的表面等離子體共振而產(chǎn)生特征吸收峰(Singhal et al,2011)。由圖2可以看出W-AgNPs在413 nm附近出現(xiàn)了一個(gè)明顯的吸收峰, E-AgNPs在420 nm處出現(xiàn)一個(gè)吸收峰, 這證實(shí)兩種山楂提取物都成功將AgNO3還原成納米銀顆粒。另外, E-AgNPs特征峰的位置比W-AgNPs略有紅移, 說明E-AgNPs的粒徑比W-AgNPs略大, 這是由于提取物中活性成分的不同所導(dǎo)致的合成產(chǎn)物的差異。

圖2 山楂提取液及其制備的納米銀的紫外可見吸收圖譜Fig.2 UV-visible absorption spectra of hawthorn fruit extract and the synthesized AgNPs

2.2.2 透射電子顯微鏡(TEM)圖譜 通過透射電鏡能直觀有效地觀察納米粒子的形貌、分散情況和粒徑大小。從圖3a可以看出W-AgNPs顆粒為多邊形或橢圓形, 大小較為均勻, 平均粒徑為 30—60nm, 呈良好的單一分散狀態(tài); 由圖3b可以看出E-AgNPs為多邊形或不規(guī)則的顆粒, 粒徑分布范圍較大, 為10—80nm, 團(tuán)聚較為明顯。TEM觀察結(jié)果與 UV-vis光譜一致。形態(tài)結(jié)構(gòu)是評(píng)價(jià)納米銀的重要指標(biāo), 這直接關(guān)系到其光學(xué)、電學(xué)乃至生物學(xué)特性。研究表明粒徑均勻、尺寸較小、分散良好的納米銀在抑菌、靶向藥物的運(yùn)輸及醫(yī)療等應(yīng)用領(lǐng)域中具有較大的優(yōu)勢(Miri et al, 2015), 因此, 從形態(tài)指標(biāo)上判斷W-AgNPs的合成狀態(tài)較為理想。

圖3 山楂提取液制備的納米銀的透射電鏡照片F(xiàn)ig.3 TEM images of AgNPs synthesized from hawthorn fruit extract

2.2.3 X 射線衍射(XRD)檢測 為了證明制備的銀納米顆粒的晶體結(jié)構(gòu), 本研究分別對(duì) W-AgNPs和E-AgNPs進(jìn)行了 XRD測試, 如圖 4所示, 兩種納米銀樣品均在 2θ 角為 27.831°、32.243°、38.100°、44.369°和46.233°處出現(xiàn)了5個(gè)顯著衍射峰, 其中在38.100°和44.369°處分別對(duì)應(yīng)了銀納米顆粒的(111)和(200)晶面(JCPDS 卡 01-1167), 在 27.831°、32.243°和 46.233°處分別對(duì)應(yīng)了氯化銀的(111)、(200)和(220)晶面(JCPDS卡 31-1238)。這說明兩種樣品中均存在銀納米顆粒, 晶體結(jié)構(gòu)為面心立方系(fcc), 從而證明以超純水和乙醇制備的山楂提取液均可以有效地合成銀納米顆粒。而產(chǎn)物中比較強(qiáng)的氯化銀衍射峰的出現(xiàn)可能是由于山楂提取液中的生物殘基存在氯離子, 制備銀納米粒子的同時(shí)形成了氯化銀, 在前人生物合成納米銀的過程中也有類似現(xiàn)象的發(fā)生(Mandal et al,2006; Sadeghi et al, 2015a)。

圖4 山楂提取液制備的納米銀的XRD圖譜Fig.4 XRD patterns of AgNPs synthesized from hawthorn fruit extract

2.2.4 穩(wěn)定性檢測 傳統(tǒng)方法制備的納米銀溶膠顆粒易發(fā)生凝聚, 常常1個(gè)月就出現(xiàn)明顯的沉淀, 隨之失去其原有的特性(Narayananet al, 2008)。而利用山楂的提取液生物制備的W-AgNPs和E-AgNPs均有優(yōu)良的穩(wěn)定性, 在低溫避光條件下保存6個(gè)月無明顯顏色變化, 無團(tuán)聚沉淀現(xiàn)象發(fā)生。研究表明植物材料中的生物大分子物質(zhì)可以增加納米銀材料的穩(wěn)定性,能有效地防止了納米銀粒子聚集形成沉淀。并且, 植物細(xì)胞內(nèi)富含的蛋白質(zhì)、脂類、多糖、氨基酸、維生素等有機(jī)化合物在合成過程發(fā)揮還原劑、絡(luò)合劑、穩(wěn)定劑等作用, 從而影響納米銀的形狀、大小, 并賦予其獨(dú)特的生物學(xué)特性(Patilet al, 2012)。因此, 生物合成的納米銀具備優(yōu)良的特性, 越來越受到研究人員的關(guān)注。

2.3 生物合成納米銀的抑菌活性檢測

2.3.1 抑菌圈試驗(yàn) 我們首先采用瓊脂擴(kuò)散法以常規(guī)的指示菌大腸桿菌(革蘭氏陰性細(xì)菌)和金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性細(xì)菌)分別檢測 W-AgNPs和E-AgNPs的抑菌效果(表1)。由表1可以看出山楂的超純水提取物和乙醇提物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有抑菌活性, 而由這兩種提取物合成的W-AgNPs和E-AgNPs對(duì)兩種指示菌均產(chǎn)生明顯的抑菌圈, W-AgNPs的抑菌活性更強(qiáng), 對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的平均抑菌直徑分別為 10.7 mm和11.4 mm; 相比之下, E-AgNPs對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌直徑為10.3 mm, 而對(duì)大腸桿菌的抑菌直徑僅為8.1 mm, 抑菌范圍僅限于牛津杯內(nèi), 幾乎不產(chǎn)生擴(kuò)散。結(jié)合表征實(shí)驗(yàn), 我們推測由于 W-AgNPs具有較小的粒徑, 具有較好的滲透性和擴(kuò)散性, 因而表現(xiàn)出較高的抑菌活性。這與Paná?ek等(2006)的研究一致,他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納米銀粒子的抗菌作用與粒子的大小有關(guān), 粒徑越小, 抗菌活性越強(qiáng)。

表1 W-AgNPs和E-AgNPs對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑(n=3)Tab.1 The mean inhibition zone of W-AgNPs and E-AgNPs against E. coli and S. aureus (n=3)

綜合上述實(shí)驗(yàn), 我們可以看出 W-AgNPs分散均勻、粒徑小、穩(wěn)定性好, 且具有較好的抑菌活性。所以, 我們確定以山楂水提取物為還原劑和穩(wěn)定劑合成納米銀, 并在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以W-AgNPs為抑菌材料,對(duì)鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和點(diǎn)狀氣單胞菌等4種常見的水產(chǎn)病原菌進(jìn)行全面的抑菌活性測定分析。

圖5 W-AgNPs對(duì)4種水產(chǎn)病原菌的抑菌效果Fig.5 The antibacterial effect of W-AgNPs against 4 different aquatic pathogens

抑菌圈實(shí)驗(yàn)表明W-AgNPs能有效抑制供試水產(chǎn)病原菌的生長, 對(duì)病原菌產(chǎn)生顯著的抑菌圈。作為對(duì)照的山楂超純水提取液僅能對(duì)牛津杯內(nèi)的病原菌產(chǎn)生微弱的抑菌效果, 但未能形成明顯的抑菌圈; 而生理鹽水則對(duì)病原菌完全沒有抑制作用(圖 5)。不同病原菌的抑菌圈直徑各不相同, 反映了供試的4種水產(chǎn)病原菌對(duì)合成的納米銀材料的敏感性不同(表 2), 其中鰻弧菌抑菌效果最為明顯, 可作為敏感指示菌。

表2 W-AgNPs對(duì)四種海洋水產(chǎn)病原菌的抑菌圈直徑(n=3)Tab.2 Diameter of the inhibition zone of W-AgNPs against 4 aquatic pathogenic bacteria (n=3)

2.3.2 抑菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 以鰻弧菌為指示菌, 檢測W-AgNPs對(duì)其生長曲線的影響(圖5)。細(xì)菌培養(yǎng)液在600 nm下的OD值與培養(yǎng)液中細(xì)菌生長的濃度呈正相關(guān), OD值越高代表培養(yǎng)液中細(xì)菌的濃度越高,生長速度越快。由圖6可以看出10 μg/mL和20 μg/mL的 W-AgNPs對(duì)鰻弧菌都能產(chǎn)生明顯的抑制作用, 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長, W-AgNPs處理組菌液的OD值幾乎沒有發(fā)生變化; 而加生理鹽水對(duì)照組中的菌液隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長, OD值不斷增長。上述實(shí)驗(yàn)表明山楂合成的納米銀材料在液體環(huán)境中可以很好的抑制鰻弧菌的生長, 為納米銀抑菌材料在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖6 不同濃度的W-AgNPs作用下的鰻弧菌的生長曲線Fig.6 Growth curve of V. anguillarum treated with W-AgNPs in different concentrations

2.3.3 MIC和MBC的測定 采用最小抑菌濃度和最小殺菌濃度法定量評(píng)價(jià) W-AgNPs的抗菌活力, 以鰻弧菌為指示菌, 二倍稀釋法梯度稀釋 W-AgNPs溶液, 分別處理鰻弧菌菌懸液, 于 28°C恒溫培養(yǎng) 24h,觀察菌落的生長情況, 以不長菌的最低濃度為W-AgNPs的最小抑制濃度(MIC)。由表 3可以看出,從4號(hào)管開始溶液出現(xiàn)渾濁, 故第4號(hào)管中納米銀的濃度6.5 μg/mL即為W-AgNPs對(duì)鰻弧菌的MIC。然后, 取澄清的 1—3號(hào)管中的溶液 0.1 mL涂布到2216E瓊脂平板上, 于 28°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h, 觀察發(fā)現(xiàn) 1、2號(hào)管對(duì)應(yīng)平皿無菌落生長, 而 3號(hào)管對(duì)應(yīng)的平皿上長出了鰻弧菌的菌落, 故3號(hào)管對(duì)應(yīng)的納米銀濃度 12.9 μg/mL即為此活性物質(zhì)對(duì)鰻弧菌的MBC。

表3 W-AgNPs對(duì)鰻弧菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定Tab.3 MIC and MBC tests of W-AgNPs against V. anguillarum

3 討論

近年來隨著耐藥微生物的不斷產(chǎn)生, 新型抗菌劑的研發(fā)越來越受到人們的重視, 納米抑菌材料作為抗生素的替代品逐漸成為抗菌領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。目前有關(guān)納米材料抑菌的機(jī)理尚不太明確, 人們普遍認(rèn)為納米粒子可與細(xì)菌充分接觸, 直接作用與細(xì)胞膜, 使細(xì)菌細(xì)胞膜破裂, 細(xì)胞內(nèi)容物外泄; 或者透過細(xì)胞膜進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi), 與菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)的巰基、氨基等發(fā)生反應(yīng), 破壞相關(guān)酶的活性中心, 并干擾 DNA復(fù)制, 使微生物喪失分裂增殖能力, 最終導(dǎo)致其死亡(Choiet al, 2008)。

納米抗菌劑具有抗菌速效、廣譜、持久、無耐藥性等優(yōu)點(diǎn), 已制備出外科消毒劑、醫(yī)用材料、抗菌織物、抗菌涂料、抗菌塑料、抗菌陶瓷等多種抗菌材料,在紡織、醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域中具有廣泛應(yīng)用的前景。而納米抑菌材料在水產(chǎn)抗菌領(lǐng)域中的研究和利用才剛剛起步, 這方面的報(bào)道尚少。劉鵬威等(2009)研究了載銅蒙脫石納米材料對(duì)嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和副溶血弧菌等三種水產(chǎn)病原菌的殺菌效果,結(jié)果表明對(duì)3種致病菌具有較強(qiáng)的抑制作用, 對(duì)嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌的MIC均為128 μg/mL, 對(duì)副溶血弧菌的 MIC為 64 μg/mL。陳娟(2011)通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)考察了碳納米管/納米銀復(fù)合材料對(duì)黃色鏈球菌、氯酚節(jié)桿菌和芽孢桿菌三種海洋細(xì)菌的殺菌效果, 結(jié)果表明該納米復(fù)合材料對(duì)三種海洋細(xì)菌均有明顯的抑制作用。Umashankari等(2012)研究表明利用紅樹林植物生物合成的納米銀對(duì)變形桿菌、假單胞菌和黃桿菌等海洋魚類病原菌有著明顯的抑制作用,可作為抗生素的替代品來控制魚類疾病。Vaseeharan等(2010)則利用茶葉提取物成功制備出納米銀并進(jìn)行了對(duì)蝦活體實(shí)驗(yàn), 結(jié)果表明納米銀能夠顯著降低由哈氏弧菌侵染造成的對(duì)蝦致死率。

在實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上, 納米抑菌劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)際生產(chǎn)中也得到了一定的應(yīng)用, 在臺(tái)灣地區(qū)已有相關(guān)材料科技公司推出納米銀殺菌液產(chǎn)品, 取代以往養(yǎng)殖過程中的傳統(tǒng)殺菌藥物, 應(yīng)用于對(duì)蝦、石斑魚等高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水產(chǎn)品的養(yǎng)殖、苗種生產(chǎn)和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)(鐘綺文, 2014)。

綜上所述, 目前有關(guān)納米抑菌劑對(duì)水產(chǎn)病原菌抑菌方面的研究和應(yīng)用才剛剛展開, 尚缺乏系統(tǒng)的研究和數(shù)據(jù)支持。本研究首先比較了山楂超純水提取物和山楂乙醇提物合成的W-AgNPs和E-AgNPs, 通過對(duì)理化表征和生物活性的比較, 最終確定 W-AgNPs較為理想。在此基礎(chǔ)上, 通過檢測該綠色合成的納米銀制劑對(duì)鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和點(diǎn)狀氣單胞菌等4種常見的水產(chǎn)病原菌的體外抑菌效果, 為納米材料在水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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