程鑫宇，吳小榮，賈博深，沙建軍，陳勇輝，黃吉煒，張進，劉東明，黃翼然(上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院，上海200001)

下調FoxM1基因表達對腎癌786-O細胞生物學行為的影響

程鑫宇，吳小榮，賈博深，沙建軍，陳勇輝，黃吉煒，張進，劉東明，黃翼然
(上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院，上海200001)

摘要:目的觀察下調腎癌786-O細胞中叉頭框轉錄因子M1( FoxM1)基因的表達對腎癌細胞生物學行為的影響。方法采用FoxM1的干擾序列和短發(fā)夾RNA( shRNA)構建shFoxM1質粒。將786-O細胞分為shFoxM1組與對照組，分別轉染shFoxM1、scramble質粒48 h。分別用Real-time PCR、Western blot法檢測細胞FoxM1 mRNA及蛋白，平板克隆形成實驗觀察1周細胞克隆形成率，采用流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡率，Transwell實驗觀察細胞遷移和侵襲能力，MTT法檢測細胞培養(yǎng)0、24、48、72 h時的細胞吸光度值。結果與對照組比較，shFoxM1組FoxM1 mRNA和蛋白表達減少，細胞克隆形成率、細胞吸光度值降底，G1期細胞比例增加而G2、S期減少，早期凋亡率增加，遷移、侵襲的穿膜細胞減少，P均＜0.05。結論下調FoxM1基因表達，可抑制腎癌786-O細胞的增殖、遷移、侵襲能力，使細胞阻滯于G1期，促進細胞的早期凋亡。

關鍵詞:叉頭框轉錄因子M1;腎腫瘤;透明細胞癌;細胞增殖;細胞凋亡;核糖核酸干擾技術

Effect of down-regulating FoxM1 expression on biological behavior of renal cancer 786-O cells

CHENG Xin-yu，WU Xiao-rong，JIA Bo-shen，SHA Jian-jun，CHEN Yong-hui，HUANG Ji-wei，ZHANG Jin，LIU Dong-ming，HUANG Yi-ran
( Renji Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200001，China)

Abstract:Objective To observe the down-regulation of forkhead box protein M1 ( FoxM1) gene expression and to investigate its effect on the biological behavior of human renal cancer cell line 786-O.Methods The shFoxM1 plasmid was constructed by RNA interference sequence and shRNA.786-O cells were divided into the shFoxM1 group and the control group which were transfected with shFoxM1 plasmid and scramble plasmid for 48 h，respectively.The expression of FoxM1 mRNA and protein was tested by real-time PCR and Western blotting.Then we analyzed the efficiency of plate colony formation in one week by using colony formation assay，and we used flow cytometry to detect the cell cycle and apoptosis of 786-O cells.The migration and invasion abilities were analyzed by Transwell assay，and the OD value in 0，24，48 and 72 hours was tested using MTT assay to analyze the activity of proliferation.Results Compared with the control group，the FoxM1 mRNA and protein expression was decreased，the efficiency of plate colony formation and the cell proliferation were decreased，the cells were blocked in G1phase，cells of G2phase and S phase reduced，the early apoptosis rate rose and the migration and invasion cells were decreased in the shFoxM1 group ( all P＜0.05).Conclusions Down-regulating FoxM1 gene expression suppressed the proliferation，migration and invasion abilities of 786-O cells，blocking cells in G1phase and promoting early apoptosis.

Key words:forkhead box protein M1; kidney neoplasms; clear cell carcinoma; cell proliferation; apoptosis; RNA interference technology

腎癌是常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，近年來發(fā)病率和病死率持續(xù)上升［1，2］，腎透明細胞癌( ccRCC)是其主要病理類型［3］。叉頭框轉錄因子M1( FoxM1)是一種增殖性轉錄因子，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［4，5］;其可通過對多種靶蛋白的轉錄激活作用影響腫瘤細胞的生物學行為，如細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等［6］。2015年1～4月，我們構建了靶向FoxM1基因的短發(fā)夾RNA( shRNA)，并將其轉染人腎癌786-O細胞，觀察下調FoxM1表達對腎癌細胞生物學行為的影響?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料人ccRCC細胞株786-O為仁濟醫(yī)院泌尿外科自有;轉染試劑X-tremeGENE HP( Roche，Switzerland) ; Opti-MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清( FBS)、胰酶、TRIzol ( Life technologies，USA) ;逆轉錄試劑盒、SYBR Green I kit ( TaKaRa，Japan) ;兔抗人FoxM1抗體( Santa Cruz，USA) ;二甲基亞砜( DMSO)、牛血清白蛋白( BSA) ;四甲基偶氮唑鹽( MTT)、碘化丙啶( PI)、鼠抗人GAPDH抗體( Sigma-Aldrich，USA) ;辣根過氧化物酶( HRP)標記的抗兔、抗鼠二抗( DAKO，USA) ;總蛋白提取試劑盒(碧云天，中國) ; Matrigel膠、Transwell小室及Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒( BD，USA) ;限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶( NEB，USA) ; pRFP-C-RS質粒、scramble質粒( OriGene，USA)。

1.2 shFoxM1構建根據Genbank設計針對FoxM1的干擾序列，由Invitrogen中國公司合成，經Blast檢測不與其他人類基因互補;頸環(huán)結構為TCAAGAG，5'及3'端引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位點;正義鏈為5'-GATCGCTTGCAGCCAATCGTTCTCT GACAGAAGGTCAAGAGGAACGTCGGTTAGCAAGAGACTGTCTTCCTTTTTTGA-3'，反義鏈為5'-AGCTTCAAAAAACTTGCAGCCAATCGTTCTCTGACAGAAGGCTCTTGAGAACGTCGGTTAGCAAGAGACTGTCTTCCC-3'，經上海鉑尚生物技術有限公司測序證實。

1.3細胞分組與轉染將786-O細胞于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分為shFoxM1組、對照組，每組約5×106個細胞。待各組細胞生長融合至70%時，將shFoxM1組、對照組按照X-tremeGENE HP說明書［7］分別轉染shFoxM1、scramble質粒(陰性對照)，轉染后將細胞置于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。以熒光顯微鏡下觀察到＞15%的細胞被紅色熒光標記，為轉染成功。

1.4相關指標觀察

1.4.1 FoxM1 mRNA表達檢測采用Real-time PCR法。根據PrimerBank設計FoxM1基因PCR引物，由上海鉑尚生物技術公司合成。FoxM1上游引物: 5'-GGAGCAGCGACAGGTTAAGG-3'，下游引物: 5'-GTTGATGGCGAATTGTATCATGG-3'; GAPDH:上游引物5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。反應條件: 95℃10 min，95℃15 s，60℃退火1 min，共40個循環(huán)。采用相對定量法計算2－ΔΔCt值，以此表示FoxM1 mRNA相對表達量。

1.4.2 FoxM1蛋白表達檢測采用Western blot法，檢測各組FoxM1蛋白表達。所有操作均嚴格按照使用說明書進行，實驗重復3次，以目的蛋白與β-actin電泳條帶吸光度比值表示FoxM1蛋白表達量。

1.4.3細胞增殖觀察采用MTT法。取各組細胞以2×103/孔接種于96孔板培養(yǎng)，每組12個復孔。于培養(yǎng)0、24、48、72 h時各取3個復孔，棄去原培養(yǎng)液后每孔加入含0.5 mg/mL MTT的新鮮培養(yǎng)液100 μL，37℃孵育4 h ;吸去培養(yǎng)液，加入DMSO 100 μL/孔，搖床輕搖15 min;待紫色結晶充分溶解后，在酶標儀上570 nm處測量并記錄每孔吸光度值，取每組平均值。

1.4.4細胞克隆形成觀察取各組細胞，胰酶消化后充分吹打至細胞分散;接種于6孔板中，5× 102/孔;每組3個復孔，置于37℃含5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。用70%乙醇固定，0.5%結晶紫染色10 min;將6孔板倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，肉眼計數(shù)各孔克隆數(shù)目，取平均值?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.4.5細胞周期和凋亡觀察①細胞周期檢測:取各組細胞，70%乙醇4℃固定30 min; PBS洗滌，用500 μL PBS重懸;加入2.5 mg/mL PI 10 μL及1 mg/mL RNA酶10 μL，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min;上BD FACS calibur流式細胞儀，測算G1期、G2期和S期細胞比例。②細胞凋亡檢測:取各組細胞，重懸后室溫避光條件下分別予Annexin V/FITC及PI染色15 min;上BD FACS calibur流式細胞儀，計算早期及晚期細胞凋亡率并取平均值。

1.4.6細胞遷移及侵襲觀察取各組細胞，經無血清RMPI-1640培養(yǎng)基饑餓處理2 h;用含0.1% BSA的無血清RMPI-1640培養(yǎng)基重懸，至細胞密度為1× 106/mL(遷移)或5×105/mL(侵襲)。將Transwell小室置于24孔板中，完成基底膠包被過程(遷移實驗無

需此步驟) ;上室加200 μL細胞懸液，下室加500 μL 含10%FBS的新鮮培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后取出小室，棉簽擦掉上室面細胞; PBS輕洗2遍，倒置風干;70%乙醇固定，0.1%( w/v)結晶紫染下室面15 min，PBS輕洗1遍后風干。顯微鏡下計數(shù)5個視野的細胞，以平均數(shù)表示遷移或侵襲能力。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1兩組FoxM1 mRNA及蛋白表達比較見表1。

表1　兩組FoxM1 mRNA及蛋白表達比較(±s)

表1　兩組FoxM1 mRNA及蛋白表達比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別FoxM1 mRNA 蛋白shFoxM1組　20.57±5.35*　25.33±5.60*對照組100.00±6.48　100.00±7.37

2.2兩組細胞增殖情況比較見表2。

表2　兩組細胞增殖情況比較(±s)

表2　兩組細胞增殖情況比較(±s)

注:與對照組同時點比較，*P＜0.05。

組別吸光度值0 h　24 h　48 h　72 h shFoxM1組　0.20±0.01 0.23±0.04 0.28±0.06*0.45±0.04*對照組0.20±0.04 0.25±0.01 0.39±0.05 0.62±0.03

2.3兩組細胞克隆形成率比較接種后1周時，shFoxM1組、對照組細胞克隆形成率分別為7%、18%，P＜0.05。

2.4兩組細胞周期和凋亡率比較見表3。

2.5兩組細胞遷移及侵襲情況比較遷移實驗中shFoxM1組、對照組穿膜細胞分別為( 240.67± 96.32)、( 989.33±100.47)個，P＜0.05;侵襲實驗中shFoxM1組、對照組穿膜細胞分別為( 20.30± 7.41)、( 83.00±5.86)個，P＜0.05。

表3　兩組細胞周期和凋亡率比較( %，±s)

表3　兩組細胞周期和凋亡率比較( %，±s)

注:與對照組同時點比較，*P＜0.05。

組別細胞周期G1期　G2期　S期凋亡率早期　　晚期shFoxM1組　47.94±3.23*　2.76±1.43*　49.30±2.98*　12.33±1.50*9.29±2.00對照組　34.16±3.34　8.96±4.33　56.88±2.56　1.40±0.50　8.35±1.10

3　討論

腎癌占全身惡性腫瘤的2%～3%［8］，根治性手術為其主要治療方法;但早期局限性腎癌術后仍有30%可能發(fā)生遠處轉移［9］，預后較差。腎癌對放療、化療及免疫治療均不敏感，治療有效率＜20%［10］。

FoxM1是一類增殖性轉錄因子，廣泛表達于哺乳動物組織中，與細胞增殖、更新、分化、遷移、有絲分裂及DNA損傷修復等［11］多種細胞生物學功能密切相關。其在肝癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤中高表達。全基因組分析顯示，其可能是惡性腫瘤中表達上調頻率最高的基因之一［12］，且腫瘤發(fā)生早期即出現(xiàn)高表達［13］，提示其可能是促使腫瘤發(fā)生及進展的關鍵因子之一。我們前期研究顯示，與正常腎組織相比，腎癌組織中FoxM1蛋白表達明顯增高，且與患者預后有關，提示其可能與腎癌發(fā)生、發(fā)展有密切關聯(lián)［14］。

Janus等［15］研究發(fā)現(xiàn)，對有絲分裂過程中紡錘體正確裝配起重要作用的中心體蛋白CEP55可能是FoxM1下游靶基因，可能是FoxM1促進腫瘤細胞增殖的機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，使用shRNA下調FoxM1表達可明顯抑制786-O細胞的增殖能力及克隆形成能力。說明FoxM1是促進腎癌細胞增殖的重要因子之一，其機制可能與FoxM1促進增殖相關細胞因子的轉錄有關。本研究同時發(fā)現(xiàn)，shFoxM1組處于G1期細胞比例明顯增加，S期及G2期細胞比例減少，說明抑制FoxM1的表達可使786-O細胞發(fā)生G1期阻滯。FoxM1作為重要的轉錄因子，可調控Cyclin D1、Cyclin B1等周期相關因子的轉錄;抑制FoxM1表達后下調相關因子水平，從而阻斷正常細胞周期。同時，流式細胞術檢測表明抑制FoxM1表達可明顯促進凋亡特別是早期凋亡，提示FoxM1在腎癌細胞中具有抗凋亡作用。有研究表明，干擾FoxM1表達后，Caspase-3活化增多［16］; Kalin等［17］發(fā)現(xiàn)，干擾前列腺癌細胞中FoxM1表達，可下調Bcl-2表達。因此，F(xiàn)oxM1可能通過參與對細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3等多種凋亡相關分子的轉錄調控發(fā)揮其抗凋亡作用。Wang等［18］研究表明，F(xiàn)oxM1可通過調控c-Jun氨基末端激酶1的轉錄促進細胞侵襲，從而促進腫瘤進展。說明FoxM1不僅在細胞增殖中具有重要作用，同時也參與了腫瘤侵襲轉移過程的調控。基質金屬蛋白酶家族( MMPs)可通過降解細胞外基質成分，在腫瘤侵襲及轉移過程中扮演關鍵角色，且在多種腫瘤組織中高表達［19］。FoxM1可激活MMPs成員如MMP2、MMP9表達，Wang等［20］研究表明，F(xiàn)oxM1B轉基因小鼠中，MMP9呈過表達。Kong等［21］研究表明，在肺癌細胞中過表達

FoxM1可增強TGF-b1誘導的上皮間質轉化能力，而EMT可促進腫瘤細胞浸潤及腫瘤轉移，敲除FoxM1則可逆轉其EMT作用。本研究結果顯示，抑制FoxM1表達后786-O細胞遷移能力與侵襲能力均明顯降低，可能與FoxM1對MMPs的激活作用及促使細胞表達間質細胞標志物從而增強EMT作用有關，具體機制有待于進一步研究。綜上所述，F(xiàn)oxM1的表達與腎癌細胞的生物學行為密切相關，有望成為腎癌治療的新靶點。

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收稿日期:( 2015-04-12)

通信作者簡介:劉東明( 1961-)，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，研究方向為腎癌的基礎與臨床。E-mail: liudm541@126.com

作者簡介:第一程鑫宇( 1990-)，男，碩士，研究方向為泌尿系統(tǒng)腫瘤的基礎與臨床。E-mail: jobberknoll90@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目( 81402084) ;上海市衛(wèi)生局課題資助項目( 2012206)。

文章編號:1002-266X( 2015) 30-0001-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R737.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.001