倪清蓉，洪環(huán)宇，孔 靜，侯慧媛，梁宏亮，金振曉，劉金成

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間充質(zhì)干細(xì)胞與缺血性心臟病

倪清蓉，洪環(huán)宇，孔 靜，侯慧媛，梁宏亮，金振曉，劉金成

［關(guān)鍵詞］：缺血性心臟??；間充質(zhì)干細(xì)胞

作者單位：710032，西安，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅（倪清蓉，洪環(huán)宇），第四軍醫(yī)大學(xué)研究生管理大隊(duì)（孔 靜），第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科（侯慧媛），第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科（梁宏亮，劉金成）

缺血性心臟病是現(xiàn)代社會(huì)危害人類健康的重大疾病。心肌細(xì)胞是一種傳統(tǒng)意義上的終末分化細(xì)胞，缺血壞死或凋亡后再生困難，因此，目前臨床所有的再血管化治療難以恢復(fù)已死亡的細(xì)胞。干細(xì)胞療法為缺血性心臟病提供了新的思路。其中骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）獲取相對容易，免疫源性低，不涉及道德倫理學(xué)及法律問題，在體外培養(yǎng)容易大量擴(kuò)增且仍然保留“干細(xì)胞”特性，而成為修復(fù)損傷心肌的最佳候選細(xì)胞。

1　MSCs的定義、鑒定與生物學(xué)特性

骨髓MSCs約占骨髓有核細(xì)胞的十萬分之一到一百萬分之一。但是MSCs能夠在體外大量擴(kuò)增。目前國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)來定義MSCs：①在穩(wěn)定培養(yǎng)狀態(tài)下貼壁生長；②表達(dá)CD73，CD90 和CD105等表面分子，但不表達(dá)CD34，CD45，HLADR，CD14，CD11b，CD79a，或者CD19等分子；③在體外培養(yǎng)體系中可分化為成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)MSCs可轉(zhuǎn)分化為包括心肌細(xì)胞的中胚層來源細(xì)胞［1］。MSCs具有種屬特異性，人MSCs和小鼠MSCs表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)志物存在一定的差異性。其中人和鼠的MSCs都表達(dá)CD29，CD51，CD73，CD90和CD105分子，但不表達(dá)CD31，CD45或者造血干細(xì)胞的標(biāo)志物［2］。雖然Durairaj等報(bào)道小RNA21（miR-21）可以作為MSCs的鑒定標(biāo)志物［3］，但鑒定MSCs的干細(xì)胞特性最可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)仍然是誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，即MSCs在體外培養(yǎng)時(shí)添加不同的誘導(dǎo)分化物質(zhì)，能夠分化為骨、脂肪、軟骨等組織類型。

MSCs可以通過分泌多種細(xì)胞因子，如生長因子、白細(xì)胞介素（LI）等，還可以分泌mRNA，miRNA和外泌體等分子［4］。其分泌的細(xì)胞因子一般可以分為兩類：第一類為有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，比如LI-1、LI-6、LI-7、LI-8、LI-11、LI-14和LI-15，巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞集落刺激因子等［5］；第二類為與血管生成或血管發(fā)生有關(guān)的細(xì)胞因子，比如血管內(nèi)皮生長因子（f vascular endothelial growth factor，VEGF）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胎盤生長因子、單核細(xì)胞趨化蛋白1等。值得注意的是，VEGF主要為促血管生長，而PEDF是VEGF的拮抗劑，主要為具有明顯抗血管生成作用的因子。研究顯示MSCs同時(shí)會(huì)產(chǎn)生這兩種相互拮抗的因子，但兩者表達(dá)量不同。在骨髓MSCs中，一般情況下PEDF的表達(dá)量高于VEGF；但在不同環(huán)境中，BM?SCs可以通過表達(dá)VEGF與PEDF的相對量不同，對血管的生成起著重要的調(diào)節(jié)作用［6］。

MSCs有獨(dú)特的免疫學(xué)性質(zhì)。首先，MSCs表達(dá)的多種分子在T細(xì)胞上都有相應(yīng)的配體，比如：主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類分子（MHC-Ⅰ）、MHC-Ⅱ（低表達(dá)）、CD90，CD106，CD166等［7］，這說明MSCs可以刺激T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。但MSCs的免疫原性很低。因?yàn)镸SCs缺乏共刺激分子CD80 與CD86［8］，使得T細(xì)胞缺乏第二活化信號(hào)刺激而不能被激活。同種異體MSCs與自體MSCs在體內(nèi)有相似的生物學(xué)效應(yīng)，并且同種異體MSCs不被自體免疫系統(tǒng)排斥［9］。甚至有研究結(jié)果顯示把異種MSCs移植于體內(nèi)后仍不產(chǎn)生排斥反應(yīng)［10］。這種獨(dú)特的免疫特惠性使得MSCs在臨床應(yīng)用中有巨大的優(yōu)勢。另外，MSCs可以作用于輔助T細(xì)胞Ⅰ型（Th1）、Th2、自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，例如抑制T細(xì)胞的活性、抑制B細(xì)胞的增殖等，改變了這些細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的特性。這些具有免疫抑制作用的特性在不同的動(dòng)物模型中也同樣可以檢測出來，并且這種免疫抑制的作用可以通過MSCs具有的分泌許多免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)（LI-10，腫瘤生長因子-β）的能力加以合理解釋。最新的研究表明，MSCs免疫調(diào)節(jié)的能力建立在細(xì)胞直接接觸的基礎(chǔ)之上，但是對于其與免疫細(xì)胞可能具有的生理相關(guān)性還需要進(jìn)一步確認(rèn)。

2　MSCs治療缺血性心臟病的機(jī)制

在正常生理狀態(tài)下心臟處于舊的心肌細(xì)胞死亡與新的心肌細(xì)胞生成的動(dòng)態(tài)平衡之中。心臟作為人體中再生能力最弱的器官之一，只存在少量的心臟干細(xì)胞可以接受心肌凋亡或壞死后發(fā)出的信號(hào)分化成新的心肌。嚴(yán)重的心肌缺血如心肌梗死（myocar?dial infarction，MI）后，大量的心肌細(xì)胞死亡，僅依靠原位的干細(xì)胞的補(bǔ)充作用是不夠的。而骨髓MSCs擁有多向分化、自我更新、增殖、免疫抑制及體外培養(yǎng)等優(yōu)勢成為最有希望運(yùn)用于心臟缺血損傷臨床治療的干細(xì)胞。

2.1分化、旁分泌與促血管生成機(jī)制 體外研究表明，多種方法可誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞，如5-氮胞苷、血管緊張素-Ⅱ等［11］，或與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)、或直接注射入動(dòng)物心臟中也可以實(shí)現(xiàn)。經(jīng)過組織切片觀察可證實(shí)分化細(xì)胞形態(tài)與心肌細(xì)胞幾乎相同，并且通過移植到受損心臟的瘢痕處可以起到改善心臟功能，防止心臟病理重構(gòu)，促進(jìn)再生等的作用。不僅如此，MSCs還有刺激心肌干細(xì)胞再生的作用［12］。但也有研究發(fā)現(xiàn)移植入損傷處的MSCs的轉(zhuǎn)分化能力不強(qiáng)。在定量的研究中，僅有0.5%～5%的移植細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為具有心肌細(xì)胞的表型［13］。這一研究結(jié)果與移植后心肌損傷處修復(fù)的狀況不符，說明轉(zhuǎn)分化機(jī)制可能并非是修復(fù)損傷的關(guān)鍵機(jī)制。

對于缺血損傷心肌的修復(fù)，關(guān)鍵因素是供氧通道的建立及恢復(fù)。MSCs的修復(fù)效果，間接證明MSCs促進(jìn)了大血管和毛細(xì)血管網(wǎng)的重構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)MSCs可以在培養(yǎng)后轉(zhuǎn)分化包括內(nèi)皮細(xì)胞和血管SMCs在內(nèi)的血管細(xì)胞。當(dāng)MSCs移植入心梗區(qū)域后，病變部位的病理生理性變化刺激MSCs轉(zhuǎn)分化潛能，高表達(dá)CD31，vW因子，SM-肌動(dòng)蛋白等血管細(xì)胞標(biāo)志物，病變部位血管密度增加，心臟功能改善。MSCs向血管細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與病變部位的多種刺激因子等有關(guān)，并且MSCs的旁分泌機(jī)制可對血管生成有著重要促進(jìn)作用。

如前文所述，MSCs可分泌多種抗細(xì)胞凋亡及促血管生成的因子。當(dāng)MSCs移植于心梗動(dòng)物模型病變處時(shí)分泌VEGF、bFGF、肝細(xì)胞生長因子（hepato?cyte growth factor，HGF）等，是構(gòu)成修復(fù)微環(huán)境的重要因子。MSCs分泌的外泌體是一種大小為30～100 nm，由miRNA及膽固醇構(gòu)成，磷脂分子包裹的囊泡狀物質(zhì)［14］。MSCs外泌體的這種結(jié)構(gòu)可使其隨意進(jìn)入心肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞，以發(fā)揮促血管生成、抗細(xì)胞凋亡及抗炎效應(yīng)等一系列的心臟保護(hù)效應(yīng)。其中它傳遞的miR-22和miR-221是已知的重要抗凋亡分子［14］。在心肌缺血損傷后，MSCs的外泌體也可減少嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的滲入。

2.2細(xì)胞融合與線粒體轉(zhuǎn)移 MSCs移植后可在心梗處發(fā)現(xiàn)了原位細(xì)胞與供體干細(xì)胞融合的現(xiàn)象。Ac?quistapace等研究發(fā)現(xiàn)，在MSCs與成年鼠心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，細(xì)胞的不同部分可通過一種“納米管通道（TNT）”的結(jié)構(gòu)進(jìn)行聯(lián)結(jié)融合。TNT結(jié)構(gòu)包括了相互融合細(xì)胞的細(xì)胞膜及F-肌動(dòng)蛋白［15］。這些發(fā)生融合的細(xì)胞表達(dá)了類似祖細(xì)胞的許多表型，即表現(xiàn)出了“重編程”的能力。同時(shí)發(fā)現(xiàn)移植的MSCs與鄰近組織細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)移也可通過TNT實(shí)現(xiàn)，這一轉(zhuǎn)移過程可有效地改善耗氧細(xì)胞中的線粒體損傷情況。并且MSCs與心肌細(xì)胞融合也建立線粒體轉(zhuǎn)移通道，將正常功能的線粒體進(jìn)行轉(zhuǎn)移。雖然目前關(guān)于這一現(xiàn)象的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)尚未充足，隨著研究進(jìn)展，這可能是一個(gè)修復(fù)心肌損傷的重要機(jī)制。

除以上機(jī)制之外，MSCs本身具有趨化至損傷或炎癥部位的能力。研究表明體外擴(kuò)增的MSCs通過鼠尾靜脈注入動(dòng)物體內(nèi)后，大部分細(xì)胞隨后會(huì)被“招募”到損傷組織，如心肌梗死、創(chuàng)傷性腦損傷、肝纖維化變性、及各種類型的腫瘤部位等［16］。

3　MSCs治療缺血性心臟病的臨床研究進(jìn)展

3.1移植方式 干細(xì)胞在病變組織中的留存比例是療效的關(guān)鍵。MSCs可以通過外周靜脈輸注、開胸手術(shù)時(shí)直接心肌內(nèi)注射、經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射和直接心內(nèi)膜下注射等方式進(jìn)行移植。外周靜脈注射是最簡單便捷的方式，但是其留存率低，大多數(shù)細(xì)胞滯留于心肌組織外，因此，少被臨床研究采用。經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射保證了較高的移植劑量，而且與外周靜脈注射相比，MSCs表現(xiàn)出了更明顯的趨化向損傷心肌的“歸巢”現(xiàn)象，所以這是臨床試驗(yàn)中常用的方法。由于一些患者冠脈阻塞的限制，MSCs還可以通過冠狀靜脈竇注入［17］。手術(shù)時(shí)心肌內(nèi)直接注射是多數(shù)研究推薦的移植方式之一，可以直接將MSCs注入MI部位，直接靶向目標(biāo)組織，并且避免了間接方法中出現(xiàn)的許多復(fù)雜問題。但這一方法的弊端是其植入過程的侵入性損害，且可能會(huì)引發(fā)心率失常、栓塞等突發(fā)情況。組織工程技術(shù)是改善細(xì)胞移植效率的新興策略。利用水凝膠、三維支架等生物材料培養(yǎng)MSCs獲得了更好的細(xì)胞黏附性，細(xì)胞留存率提高，并創(chuàng)造了適合MSCs的生存、增殖及分化空間［18］。

3.2移植時(shí)機(jī) MI后出現(xiàn)的炎細(xì)胞浸潤、缺血再灌注損傷等會(huì)極大程度影響移植MSCs的存活率。同時(shí)，組織應(yīng)激產(chǎn)生的VEGF，HGF等生長因子上調(diào)，又可促進(jìn)移植MSCs的聚集、增殖及分化。如果移植時(shí)間過早，大量的細(xì)胞在不利的微環(huán)境中無法存活；如果移植時(shí)間過晚，病變組織不可逆的心肌損傷和血管重構(gòu)會(huì)極大地限制移植效果。所以，在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間進(jìn)行移植是保證細(xì)胞存活和移植療效的重要因素。Collins等［19］利用綠色熒光蛋白標(biāo)記的MSCs分別于MI后30 min，24 h及第5天心內(nèi)膜下注射發(fā)現(xiàn)，MSCs的損失率由心肌梗死后24 h移植時(shí)的31%下降至第5天的1%。也有研究發(fā)現(xiàn)在MI 后1～2周移植細(xì)胞MSCs的存活率高于病變后1 h移植，且左心室功能有較明顯的改善。而在MI后24 h進(jìn)行移植，雖然不能明顯改善心臟的收縮功能，但可以減小心臟的梗死面積［20］。因此，治療最佳時(shí)機(jī)可能在MI后5～14 d。

3.3移植劑量 研究表明MSCs治療心梗的劑量應(yīng)達(dá)到108以上才可以實(shí)現(xiàn)對左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）的顯著作用。Cliffold等［21］的統(tǒng)計(jì)分析也顯示移植劑量達(dá)到108以上可明顯改善嚴(yán)重心梗的預(yù)后。

4　臨床研究效果

MSCs在動(dòng)物模型被證明有良好的療效后，大量的臨床研究也在進(jìn)行。其中包括大型的隨機(jī)、雙盲對照試驗(yàn)TAC - HFT［22］和POSEIDON［23］。TAC -HFT試驗(yàn)［22］是通過心內(nèi)膜下注射細(xì)胞，比較自體MSCs（n=19）和單個(gè)核細(xì)胞（n = 19）對缺血性心臟病的療效。與對照組相比，MSCs治療組1年時(shí)嚴(yán)重不良事件發(fā)生率明顯降低，6 min步行時(shí)間延長，明尼蘇達(dá)心力衰竭評(píng)分顯著改善，梗死面積占左心室百分比顯著減小，但左心室容積和LVEF并未改善。POSEIDON試驗(yàn)［23］利用多排螺旋CT等技術(shù)比較自體MSCs和異體MSCs移植治療缺血性心臟病的效果。研究表明，治療組瘢痕面積減少了近40%；而未接受治療的患者減少了25%，并且MSCs治療的心臟節(jié)段對應(yīng)的LVEF增加了近40%，未接受治療的節(jié)段并沒有明顯改善。該試驗(yàn)不僅說明了移植MSCs部位的重要意義，而且證明了異體MSCs安全可行，有良好的治療效果。

PROMETHUS試驗(yàn)［24］檢測了6例行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者M(jìn)SCs的治療效果。該實(shí)驗(yàn)利用心臟MRI分析出與對照組相比，其LVEF增加，瘢痕面積減小，心臟收縮能力得到改善，證明了MSCs直接注入無血管區(qū)域的治療潛能。C-CURE試驗(yàn)［25］共收入45例缺血性心力衰竭患者，其中24例接受規(guī)范藥物治療，21例接受經(jīng)預(yù)處理的MSCs治療。隨訪6個(gè)月時(shí)發(fā)現(xiàn)，心源性MSCs移植未誘發(fā)任何心律失常和不良事件；MSCs組患者6 min步行試驗(yàn)的臨床表現(xiàn)顯著改善，左心室舒張末容積和收縮末容積均有所下降，LVEF增加約5%，表明受預(yù)處理的MSCs可能有更好的血管再生能力。

TOPCARE-AMI試驗(yàn)［26］的結(jié)果也顯示在治療后第4個(gè)月，LVEF增加至8.5%，而對照組只增加2.5%。而且在5年的隨訪中LVEF、收縮末期容積及舒張末期容積均有明顯改善。但相反，在BOOST試驗(yàn)［27］中，雖然經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療時(shí)注入MSCs，6個(gè)月后對照組和移植組LVEF分別增加了0.7%和6.7%；但是5年的隨訪結(jié)果表明治療效果并沒有持續(xù)。

Janssens等［20］通過自體MSCs移植后發(fā)現(xiàn)，其并不增加MI后左心室整體功能恢復(fù)，但可顯著減少梗死面積。ASTAMI和BONAMI試驗(yàn)則表明MSCs的治療并沒有明顯效果［28-29］。這些不同的研究結(jié)果表明患者的個(gè)體差異、不同的細(xì)胞培養(yǎng)方式、移植方式的采取及設(shè)置的觀測數(shù)據(jù)基準(zhǔn)線不同等因素可能都會(huì)影響到研究結(jié)果。

總體來說，應(yīng)用MSCs治療的安全性和可行性在POSEIDON，C-CURE等試驗(yàn)中都已得到證實(shí)。Lalu等［30］檢索了1950年至2011年采用MSCs治療的文獻(xiàn)，證明MSCs治療是安全的。一項(xiàng)Meta分析了16項(xiàng)大型隨機(jī)對照試驗(yàn)表明MSCs可以不同程度減少梗死面積，LVEF平均增加11.3%［31］。Jee?vanantham等研究表明接受MSCs治療后心臟功能可以得到改善，而且心肌梗死的復(fù)發(fā)率和死亡率均有所下降［32］。

致謝：本文是在侯慧媛講師、劉金成副教授指導(dǎo)下完成的，在此一并致謝。

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DOI：10.13498/ j.cnki.chin.j.ecc.2016.02.16

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81570230，81570231，81570232，81570330）

通訊作者：劉金成，liujch69＠sina.com

收稿日期：（2016?03?23）

修訂日期：（2016?04?10）