胡嚴杰 黃海榮

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·綜述·

結核分枝桿菌對吡嗪酰胺耐藥的檢測方法研究與進展

胡嚴杰 黃海榮

吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)是重要的一線抗結核藥物之一，對細胞內的結核分枝桿菌具有獨特的殺菌作用，因此成為結核病短程化療的基石。同時，鑒于目前治療耐多藥結核病新藥的缺乏，WHO建議全程使用PZA治療耐多藥結核病。結核分枝桿菌對PZA耐藥的相關基因pncA及其啟動子區(qū)的突變位置分散且類型繁多，使一般的分子學診斷方法不易進行操作與檢測。作者對現(xiàn)有的PZA耐藥性檢測方法的原理及新檢測方法的研究進行綜述與展望。

吡嗪酰胺； 分枝桿菌, 結核； 微生物敏感性試驗； 表型； 基因型； 實驗室技術和方法； 綜述

2015年全球新增結核病患者約960萬例，其中3.3%的初治患者和20%的復治患者為耐多藥結核病患者[1]。吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)可殺死處于半休眠期的結核分枝桿菌，從而將治療周期從9～12個月縮短至6個月，因而成為結核病短程化療的基石[2-3]。近年來有研究表明，使用PZA治療的原發(fā)耐多藥結核病患者的預后優(yōu)于未使用的患者[4]，因此，世界衛(wèi)生組織(WHO)建議使用PZA應貫穿耐多藥結核病患者的整個療程。然而，由于對PZA的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)需要特殊的酸性環(huán)境，使得其不易操作且結果可重復性差，因此對PZA的藥物敏感性檢測并未常規(guī)納入日常的藥敏試驗[5]。由于臨床對PZA藥敏試驗的需求，可靠的方法一直處于尋求、探索過程中，筆者將分別對PZA耐藥的表型檢測方法和分子檢測方法的檢測原理、特點進行綜述。

表型藥敏試驗方法

PZA是一種煙酰胺類似物，被轉運到巨噬細胞內后在吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase, PZase)的作用下生成吡嗪酸(pyrazinoic acid, POA)進而發(fā)揮抗結核作用[1]。POA在中性條件下以POA-的形式存在，一部分POA-通過外排作用轉運到細胞外，在酸性環(huán)境下，POA-被還原成不帶電荷的POA分子。由于POA的動態(tài)平衡，不帶電荷的分子再次被轉運到結核分枝桿菌胞內，進入時帶入一個質子，經過大量累積后結核分枝桿菌的細胞質酸化，從而導致細菌死亡[6-8]。表型藥敏試驗方法是將結核分枝桿菌與藥物共同孵育一段時間后，通過直接或間接觀察細菌的存活狀態(tài)，判斷細菌是否耐受PZA。

一、根據菌量檢測的方法

1.BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)基法：是WHO推薦的一種液體培養(yǎng)檢測MTB對PZA是否敏感的方法，是目前應用最為廣泛的PZA耐藥性檢測方法[9]。其原理是應用BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)比較一定周期內含藥培養(yǎng)管和對照管是否因耗氧量不同而激發(fā)產生不同強度的熒光，從而推測含藥培養(yǎng)管中的菌量占對照培養(yǎng)管菌量的比例，并由此判斷細菌是否耐受PZA。此方法中PZA的終濃度為100 μg/ml，液體培養(yǎng)基的pH值設定為6.0[10]，21 d后可得到檢測結果，是目前認可度較高的PZA藥敏試驗方法。歐洲的一項研究以BACTEC 460為參照標準，應用MGIT 960系統(tǒng)進行的PZA藥敏試驗結果與其一致率達到98.3%[10]。

2.VersaTREK-ESP System Ⅱ的PZA藥敏試驗法：其原理是將VersaTREK全自動微生物探測系統(tǒng)(VTI)及ESP?培養(yǎng)系統(tǒng)Ⅱ(ESP)配合使用，通過連續(xù)監(jiān)測(24 min/次，若無陽性信號出現(xiàn)，最多檢測12 d)培養(yǎng)瓶頂空中氧氣的消耗率檢測分枝桿菌的生長，并通過陽性信號報告生長響應。在生長對照瓶檢測報陽后3 d內含藥生長瓶也報陽則為耐藥，反之則為敏感。此方法同樣需要酸性環(huán)境，PZA終濃度為300 μg/ml，但僅需14 d即可得到結果。該方法檢測結果文獻報道顯示，以BACTEC 460為金標準，該方法的敏感度為88.0%，特異度為92.3%[11]。Espasa等[11]的一項以BACTEC MGIT 960為對照的研究中，顯示其敏感度和特異度分別為97.0%和100.0%。

以上兩種方法均需要昂貴的設備和試劑，影響了其在臨床上的全面推廣，而且越來越多的報道認為此類藥敏試驗的可重復性不夠理想，原因可能有以下幾種因素：(1)酸性環(huán)境不利于結核分枝桿菌的生長[12]；(2)接種量依靠比濁法稀釋細菌確定，肉眼觀察誤差較大，易出現(xiàn)假陽性[13]；(3)PZA對不同生長狀態(tài)的結核分枝桿菌的殺傷力不相同[14]。

二、PZase活性檢測法

1.韋恩法(Wayne法)：在PZase催化下PZA轉化為具有還原性的POA，而轉運到細菌膜外的POA分子可與硫酸亞鐵氨發(fā)生反應生成紅色的硫酸亞鐵。將結核分枝桿菌接種到含有PZA的固體培養(yǎng)基上，4 d后向培養(yǎng)基上滴加硫酸亞鐵銨，通過觀察培養(yǎng)基顏色變化可以推測是否有POA生成，從而判斷PZase是否具有活性。PZase有活性表明細菌對PZA敏感，否則判定為耐藥。Cui等[10]的一項研究表明，以MGIT 960系統(tǒng)進行的PZA藥敏試驗作為對照，Wayne法的敏感度為88.2%，特異度為98.5%。該方法操作簡單，特異度較高且檢測周期短，但其敏感度較低，操作需要菌量較大，可重復性較差，因此沒有得到廣泛認可[15-16]。

2.底物類似物顯色法：煙酰胺是PZA類似物，其也能在PZase的作用下轉化成活性狀態(tài)，且該轉化無需酸性環(huán)境，因此有學者嘗試用煙酰胺替代PZA作為底物檢測結核分枝桿菌的PZase活性[17]。本方法的基本原理與Wayne法相似，但結果判定采用結核分枝桿菌液體藥敏試驗常用的比色法。常見的比色法包括：刃天青微量滴定分析法(resazurinmicrotiter assay, REMA)、硝酸鹽還原法(nitrate reductase assay, NRA)和噻唑藍比色法(MTT法)。Cui等[10]的一項研究結果顯示，以MGIT 960法為標準，MTT法的敏感度為97.0%，特異度為99.6%。而泰國的一項研究結果顯示，以MGIT 960法作為對照，MTT的敏感度僅為88.0%，特異度為78.0%[18]。比色法操作簡便，不需要特殊儀器，結果易于判定，成本低，且能在10～14 d得到藥敏試驗結果。該方法利用煙酰胺替代PZA，解決了檢測pH值和結核分枝桿菌生長所需pH值矛盾的問題；但該方法缺乏標準化，因此尚無法推廣[10,17]。

耐藥基因突變檢測技術

PZase是由MTB的pncA基因編碼的蛋白，研究表明pncA基因及其啟動子區(qū)序列的突變是造成PZase活性降低或缺失的主要原因[19]，也是對PZA產生耐藥的主要原因。

pncA基因全長561 bp，基因及其啟動子序列的突變形式包括點突變、插入和缺失，可能發(fā)生突變的堿基幾乎覆蓋了整個基因，因此不便于應用常用的基于探針雜交的分子檢測技術，諸如分子信標法、TaqMan探針法等。同時，有報道認為pncA基因突變不一定造成PZA耐藥，如Ramirez-Busby等[20]的Meta分析發(fā)現(xiàn)83%的pncA基因突變會造成對PZA耐藥，而17%的pncA基因突變不會造成耐藥。這一因素大大削弱了通過檢測pncA基因及其啟動子區(qū)的序列差異來診斷結核分枝桿菌對PZA耐藥的價值。不過，鑒于作為對照方法的結核分枝桿菌PZA耐藥表型藥敏試驗方法存在不可靠的問題，分子檢測技術的真實價值仍有待更多的評估，而鑒于其耗時短的優(yōu)勢，因此這一領域仍然激發(fā)了很多研究興趣。

1. DNA序列測定技術：DNA測序技術是一種分析特定DNA序列堿基排列的技術，可以對DNA的突變進行定位和鑒定研究。2011年的一篇綜述分析顯示，以MGIT 960法作為對照，DNA測序技術診斷結核分枝桿菌對PZA耐藥的敏感度和特異度分別為90.0%和 94.0%；以BACTEC 460法為標準時，DNA測序技術的敏感度和特異度分別為87.0%和95.0%；以MGIT 960法作為對照時，DNA測序技術的敏感度和特異度分別為85.0%和88.0%[21]。DNA測序技術是突變檢測的“金標準”，隨著該技術自動化程度的提高及成本的降低，DNA測序技術將成為未來基因檢測的常規(guī)手段。

2. Surveyor酶酶切法：Surveyor酶是植物中提取的核酸內切酶，它與普通內切酶不同之處在于其可特異性切割DNA錯配部位，這種切割對核苷酸序列無特殊要求，不需要知曉pncA突變的具體位置和類型[22]。該方法先將野生型pncA基因的PCR產物和待測樣品的pncA基因的PCR產物混合，在變性和復性過程中，形成同源或異源雙鏈，在Surveyor 酶作用后電泳，如果待測樣品沒有突變、插入和缺失位點，則Surveyor酶不能發(fā)揮作用，電泳圖譜上僅有單個條帶；如果待測樣品含有突變、插入和缺失位點，則形成一條異源雙鏈和一條同源雙鏈，此時Surveyor酶發(fā)揮作用，將異源雙鏈切斷，此時電泳圖譜上有3條或者更多條帶[22]。有一項研究采用該方法分析了10株臨床分離株對PZA的耐藥性，僅有1株與PZase活性檢測結果不一致[23]。采用Surveyor酶酶切法操作簡單，無需特殊儀器，具有推廣價值。該技術已經應用在其他疾病的基因突變檢測，但在結核病檢測方面應用較少。

3. 高分辨率熔解曲線(high resolution melt，HRM)：HRM是新近發(fā)展起來的建立在實時熒光定量PCR基礎上的突變檢測技術。HRM將野生型樣品和待測樣品加到同一樣本管中進行PCR后雜交形成同源或異源雙鏈，利用飽和熒光染料能與雙鏈DNA進行特異性結合，利用同源雙鏈和異源雙鏈的熔解溫度不同、熒光染料脫落的溫度也不相同來區(qū)分野生型和突變型。該方法通過設計交叉引物覆蓋pncA及其啟動子序列，通過多管檢測即可分析出pncA及其啟動子序列的基因型，不需要知道突變的堿基位點和突變類型。有研究者用HRM技術分析了127株臨床分離株，并與BACTEC MGIT 960藥敏試驗結果對比，其敏感度為85.5%，特異度為98.5%[24]。HRM法是閉管檢測，從而避免了污染造成的假陽性。目前，HRM技術已經在結核病耐藥分子診斷領域得到應用，未來此項技術也有希望用于結核分枝桿菌對PZA耐藥的分子檢測。

4. 微陣列技術：微陣列片技術采用原位合成或微量點樣等方法，將已知序列的DNA片段固定在支持物表面，然后采用含有特異性標記的樣品分子進行雜交，通過檢測特異性信號強度來獲取樣品的序列信息。有研究者設計了79種特異性探針序列檢測結核分枝桿菌對PZA耐藥的pncA基因，其結果與測序一致[25]。這說明該方法具有很高的敏感度和特異度，可快速識別設定的突變位點，但微陣列技術需要大量探針，且雜交過程操作復雜，因此易于發(fā)生污染。未來自動化技術的發(fā)展可能有助于解決這些問題，但是此技術需要昂貴的儀器設備，極大地限制了該技術的臨床應用。

問題和展望

雖然臨床目前對PZA進行藥敏試驗的檢測技術很多，但現(xiàn)有技術都存在不同程度的缺陷。對PZA進行表型藥敏試驗的難點在于液體培養(yǎng)技術需要pH=5.5～6.0的條件，而結核分枝桿菌的生長需要中性環(huán)境，從而可能導致假陽性結果的出現(xiàn)；比色法和產物顯色法均不能區(qū)分PZase的活性高低，容易導致假陰性結果出現(xiàn)；基因突變檢測技術需要首先建立結核分枝桿菌對PZA耐藥與基因突變間良好的一致性關系。目前，PZA的殺菌機制還未完全闡明，相信隨著對其殺菌機制和耐藥機制研究的不斷深入，同時隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，未來一定能夠建立可靠而實用的PZA藥敏試驗的檢測方法。

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(本文編輯：王然 李敬文)

Progress of pyrazinamide-resistanceMycobacteriumtuberculosisdetection

HUYan-jie,HUANGHai-rong.

NationalTuberculosisClinicalLaboratory,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

HUANGhai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

Pyrazinamide (PZA) is one of the most potent anti-tuberculosis (TB) drugs which has unique bactericidal activity within cells, therefore, it is the core of short-course chemotherapy for TB. Recently, WHO suggested using PZA through out the treatment course of multiple drug-resistant TB because of lack of new drugs. As location of the mutation in the promoter is scattered and the types are various,pncAgene, which is related with PZA-resistant, is difficult to be detected using the general molecular test. In this article, the advancement of PZA-resistance TB detection will be reviewed.

Pyrazinamide;Mycobacteriumtuberculosis; Microbial sensitivity tests; Phenotype; Genotyp; Laboratory techniques and procedures; Review

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.014

101149 北京市結核病胸部腫瘤研究所 國家結核病臨床實驗室

黃海榮，Email：huanghairong@tb123.org

2016-07-05)