哺乳動物耳蝸毛細胞再生的研究現(xiàn)狀

丁晨茹　遲放魯

?

·綜述·

哺乳動物耳蝸毛細胞再生的研究現(xiàn)狀

丁晨茹遲放魯

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科上海200031

【摘要】耳蝸毛細胞通過頂部纖毛的運動將聲信號轉(zhuǎn)換為電信號，通過蝸核等聽覺中樞傳導(dǎo)至聽覺皮質(zhì)而產(chǎn)生聽覺。環(huán)境、藥物及遺傳等因素可導(dǎo)致哺乳動物內(nèi)耳毛細胞的損傷和死亡，嚴重影響聽力。研究表明，哺乳動物可通過不同途徑實現(xiàn)耳蝸毛細胞再生。本文旨在對目前耳蝸毛細胞再生的研究進展進行綜述。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：57-59)

【關(guān)鍵詞】耳蠟；毛細胞；再生；前體細胞；轉(zhuǎn)錄因子；基因

衰老、強聲刺激、環(huán)境化學(xué)毒素、氨基糖苷類藥物以及先天遺傳等可損傷毛細胞引起聽覺障礙。毛細胞再生一直是重塑聽覺功能方面的研究熱點，學(xué)者們爭相探討以期能找到治療神經(jīng)性聾的方法。對其前體細胞的來源、再生毛細胞的分化成熟、神經(jīng)的再支配及相關(guān)調(diào)節(jié)機制的研究已取得一定程度的進展，本文對此做一綜述。

1哺乳動物毛細胞再生的現(xiàn)狀

與鳥類等不同，哺乳動物內(nèi)耳毛細胞損傷后不能自發(fā)產(chǎn)生新的毛細胞。Forge等[1]以及Warchol等[2]于1993年發(fā)現(xiàn)哺乳動物毛細胞經(jīng)慶大霉素損傷后再生成為具有未成熟毛細胞表型的細胞。White等[3-4]在對出生后小鼠支持細胞進行體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)毛細胞有由支持細胞轉(zhuǎn)分化再生的潛在可能。Kawamoto等[5]證實氨基糖苷類藥物損傷橢圓囊毛細胞后可自發(fā)再生修復(fù)，并分化成為具有Ⅱ型毛細胞表型的成熟細胞。噪聲暴露損傷豚鼠毛細胞后從圓窗處以腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Atoh1介導(dǎo)再生，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)損傷的毛細胞靜纖毛束存在自我修復(fù)以及再生，聽覺腦干誘發(fā)電位閾值降低，提示在噪聲暴露的早期，細胞損傷死亡之前，可通過此途徑修復(fù)聽力[6]。

Atoh1異位表達誘導(dǎo)再生的毛細胞出現(xiàn)CSP、突觸小泡蛋白、突觸結(jié)合蛋白1，提示再生毛細胞存在與神經(jīng)纖維的突觸連接[7]。Kuo等[8]觀察到新生毛細胞位于內(nèi)生毛細胞周圍，基底膜外側(cè)出現(xiàn)Tuj1(+)標記神經(jīng)再支配的出現(xiàn)，但突觸前ctbp2與突觸后GluR2不完整匹配與交疊，功能恢復(fù)需要進一步完善。

2毛細胞再生的前體細胞

歷年來研究認為，受損區(qū)旁毛細胞、支持細胞、多能干細胞等可能是毛細胞再生的來源[2-3, 9-11]。Li等[9]體外培養(yǎng)橢圓囊斑感覺上皮細胞，發(fā)現(xiàn)其存在具有干細胞潛能的細胞，可自我更新并分化為不同類型的細胞。Oshima等[12]從新生小鼠Corti器及前庭感覺上皮分離出干細胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可分化成為具有多種毛細胞標記物的細胞，并且表達類似毛細胞的功能性離子通道，但是在出生2～3周后耳蝸Corti器干細胞呈百倍衰減，而前庭上皮干細胞活性在成年后得以留存。利用氨基糖苷類損傷成熟哺乳動物毛細胞后體外培養(yǎng)內(nèi)耳感覺上皮發(fā)現(xiàn)，支持細胞轉(zhuǎn)分化成為未成熟毛細胞[3]。在耳蝸的形成過程中，毛細胞與支持細胞擁有共同的祖細胞。

2.1支持細胞作為前體細胞支持細胞作為毛細胞再生的前體細胞，有2種再生途徑：一種是支持細胞經(jīng)誘導(dǎo)激活重新進入細胞周期，通過有絲分裂進一步分化成為毛細胞及支持細胞；另一種則是通過直接轉(zhuǎn)分化的途徑而再生毛細胞[13]。White等[3]篩選出GFP(+)的P27轉(zhuǎn)基因新生小鼠耳蝸支持細胞，測試分裂后支持細胞重新進入細胞周期并且產(chǎn)生毛細胞的能力，通過共培養(yǎng)純化的支持細胞以及耳周間充質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)支持細胞聚集成小上皮島，并伴有P27表達下調(diào)以及BrdU標記的出現(xiàn)，提示有絲分裂后的支持細胞進入細胞周期并進行增殖；進一步測定毛細胞標記物肌球蛋白VI的表達，發(fā)現(xiàn)20%表達有肌球蛋白VI的細胞也含有BrdU，BrdU(+)和BrdU(-)再生毛細胞的存在表明支持細胞能夠通過有絲分裂及非有絲分裂2種途徑分別增殖分化、直接轉(zhuǎn)分化為毛細胞。

2.2支持細胞亞型Liu等[7]研究Atoh1的異位表達介導(dǎo)小鼠支持細胞轉(zhuǎn)化為毛細胞的具體機制發(fā)現(xiàn)，支持細胞2種亞型PCs(pillar cells)和DCs(Deiters’ cells)轉(zhuǎn)化為未成熟毛細胞的能力與年齡相關(guān)。新生及幼年小鼠約有10%的PCs和DCs經(jīng)靶基因Atoh1異位表達而轉(zhuǎn)化為未成熟毛細胞，而發(fā)育成熟的PCs和DCs對此并無反應(yīng)。White等[3]在實驗過程中通過檢測支持細胞2種亞型PCs和HCs(Hensen cells)的特異性表面抗原p75及Math1-GFP(+)毛細胞發(fā)現(xiàn)，此2種支持細胞具有分化為毛細胞及支持細胞的能力。在新生哺乳動物耳蝸中檢測到Lgr5表達于大上皮嵴的非感覺上皮細胞、邊緣細胞、柱細胞、指細胞以及Deiter細胞中[14-15]。在體及離體培養(yǎng)中觀察到Lgr5(+)細胞可增殖并轉(zhuǎn)化為毛細胞[8, 16]，提示Lgr5(+)細胞存在再分化毛細胞的干細胞潛能。

3毛細胞再生的調(diào)控機制

3.1轉(zhuǎn)錄因子Atoh1是毛細胞形成過程中不可缺少的一個“螺旋-環(huán)-螺旋”結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子[17]，能正向介導(dǎo)毛細胞的分化。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，組織培養(yǎng)或者體外實驗中耳蝸基底膜或者前庭感覺上皮Atoh1的異位表達會誘導(dǎo)毛細胞的再生。在體和體外實驗都表明出生前嚙齒類動物Atoh1的表達引起支持細胞分化成為感覺毛細胞，但再生的毛細胞并不能夠發(fā)育成熟，表明對于毛細胞的再生與形態(tài)功能的成熟而言，除卻Atoh1的表達之外，尚需其他的調(diào)節(jié)因子[7]。應(yīng)用β-catenin激活經(jīng)典Wnt通路并同時誘導(dǎo)Atoh1異位表達發(fā)現(xiàn)毛細胞再生數(shù)量10倍于先前報道，并且表達毛細胞標記物otoferlin, Myosin7a, parvalbumin等，但無終末成熟標記vGlut3,prestin的表達，神經(jīng)再支配突出前后受體的表達呈現(xiàn)出不完整排列[8]。體外培養(yǎng)新生小鼠Corti器誘導(dǎo)Atoh1過表達產(chǎn)生的毛細胞主要在中回，一定程度上與DAPT誘導(dǎo)的頂回毛細胞再生互補[19]，但單獨過表達Atoh1并不誘導(dǎo)產(chǎn)生靜纖毛束的極性表現(xiàn)。Prox1是細胞終末分裂和分化中間過程的重要因子，在毛細胞前體細胞及支持細胞中均有表達[20]。Prox1CreER/+可誘導(dǎo)Atoh1的異位表達，但在出生后的PC和DC中其活性明顯下降[7]。

3.2Notch通路Notch信號是調(diào)節(jié)內(nèi)耳細胞生命的重要基礎(chǔ)，通過負性調(diào)節(jié)Lgr5+前體細胞的增殖并維持耳蝸感覺上皮細胞數(shù)量和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)。一些證據(jù)表明，支持細胞Atoh1的表達是可以通過Notch信號通路旁路抑制的[21]。首先，Notch的受體和配體，以及下游效應(yīng)器 Hes/Hey家族的的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，在支持細胞中都有表達[22]。其次，Notch信號的發(fā)育過程中的基因中斷導(dǎo)致產(chǎn)生額外的毛細胞。使用DAPT抑制Notch通道活性，外周支持細胞Hes5明顯下調(diào)，支持細胞轉(zhuǎn)分化為具有毛細胞特征的細胞，并遷移到相應(yīng)的細胞層，且不伴有細胞的過量增殖[23]。另外Hes5通過抑制Atoh1阻斷毛細胞的分化。通過譜系追蹤發(fā)現(xiàn)，阻斷Notch信號之后， Wnt通路依賴的Lgr5+支持細胞經(jīng)有絲分裂方式分化為毛細胞，IWP-2阻斷Wnt通路后，EdU+/Sox2+ SCs和 EdU+/Myo7a+ HCs較前明顯降低，提示抑制Notch信號誘導(dǎo)的有絲分裂再生依賴Wnt通路，β-catenin和Wnt下游基因Sp5的上調(diào)進一步證實了二者的聯(lián)系。EdU-/Myo7a+ HCs并無明顯變化，說明Notch信號抑制后支持細胞直接轉(zhuǎn)分化為毛細胞這一過程并不依賴Wnt通路[24]。

3.3基因細胞周期依賴蛋白激酶(CDK)及其相關(guān)調(diào)控元件在細胞周期的調(diào)節(jié)中起到重要的作用。支持細胞增殖能力伴隨CDK抑制劑p27kip1而變化，具有年齡依賴性[3]。而在分化成熟的毛細胞中p27kip1表達急劇下調(diào)，出生后P19Ink4d和p21Cip1聯(lián)合突變情況下毛細胞的分裂后狀態(tài)失衡，重新進入細胞周期，推測其參與出生后毛細胞分化成熟狀態(tài)的維持。同樣的，Rb基因敲除后也出現(xiàn)毛細胞的再分裂，但由于Rb基因為腫瘤抑制基因，再生的毛細胞經(jīng)p53基因調(diào)控而凋亡。Atoh1誘導(dǎo)支持細胞轉(zhuǎn)分化成為再生毛細胞的過程中發(fā)現(xiàn)，支持細胞并不協(xié)同增殖，而合適的支持細胞及毛細胞數(shù)量是Corti器功能的基礎(chǔ)。在p27kip1基因敲除小鼠，雖然有多余的外毛細胞和支持細胞產(chǎn)生，但這些小鼠都表現(xiàn)為耳聾，極有可能是因為Corti器的生物力學(xué)完整性受到損害[3, 21]。

microRNA(mi-R)是一類非編碼小分子RNA，具有高度的保守性，廣泛存在于哺乳動物基因組中，通過抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達。研究發(fā)現(xiàn)miRNA183家族(mi-R96, mi-R182，mi-R183)在出生后小鼠內(nèi)耳毛細胞中特異性表達，mi-R182在毛細胞前體細胞中高度表達而在分化過程中表達逐漸下降。敲除mi-R183后可發(fā)現(xiàn)毛細胞數(shù)量的明顯減少，推測mi-R可作為毛細胞基因調(diào)控的一個機制[25]。

3.4蛋白分子肌動蛋白解聚因子(ADF)在組織細胞支架重建和細胞遷移中起到重要的作用，在小鼠耳蝸及前庭感覺上皮的正常發(fā)育過程中，ADF的表達具有時間和空間變化。E14.5散在表達，E18.5逐漸遷移至表皮板纖毛位置，出生后一天不再表達[26-27]，表明ADF參與哺乳動物聽覺和前庭感覺上皮毛細胞及支持細胞和毛細胞表皮板的纖毛束的發(fā)育和成熟。Atoh1異位表達介導(dǎo)的毛細胞再生過程中，Myo7a+毛細胞再生早期階段ADF的表達情況與耳蝸感覺上皮毛細胞正常發(fā)育過程中的變化相一致，但在體外培養(yǎng)的后期(12 d后)不再表達，此時并未遷移至再生毛細胞纖毛端[27]， ADF參與異位再生毛細胞的形成及結(jié)構(gòu)重建，然而最終的纖毛成熟尚需進一步的研究。

3.5藥物Namdaran等[28]研究發(fā)現(xiàn)毛細胞再生過程中，地塞米松和潑尼松龍可作為增強劑而增加毛細胞再生數(shù)量。此外毛細胞未損傷情況下，二者也能夠誘導(dǎo)毛細胞的合成并且具有劑量依賴性。對再生抑制劑的進一步分析顯示，氟苯咪唑和拓撲替康，通過防止毛細胞前體細胞增殖顯著抑制毛細胞再生。氟苯咪唑可能是通過干擾微管的正?；顒?，而使支持細胞分裂終止在M期。拓撲替康作為拓撲異構(gòu)酶抑制劑而殺死毛細胞及增殖毛細胞前體細胞。此外還存在第3類抑制劑——氟維司群，通過降低支持細胞的增殖而延遲毛細胞再生。藥物的調(diào)控機制在非哺乳動物毛細胞再生調(diào)控中嶄露頭角，為哺乳動物毛細胞再生的調(diào)控提供了新的方向及可能。

4結(jié)語

毛細胞的再生涉及多種因子及調(diào)控通道的協(xié)同作用，自20世紀80年代以來，學(xué)者們對于毛細胞再生的研究取得了一系列的成就。再生毛細胞的數(shù)量控制，細胞結(jié)構(gòu)的重建，纖毛的有效排列和運動及神經(jīng)突觸的精細對接等各個環(huán)節(jié)都起到不可或缺的作用。比如Atoh1異位表達可誘導(dǎo)的再生毛細胞，但卻不能終末成熟，纖毛的極性發(fā)育亦有所欠缺。支持細胞直接轉(zhuǎn)分化再生為毛細胞途徑并不協(xié)同增殖，使得支持細胞數(shù)量衰減，并不能夠重塑功能恢復(fù)所需的完整組織結(jié)構(gòu)。而通過調(diào)節(jié)細胞周期調(diào)控因子p27kip1可使支持細胞重新進入細胞周期，增殖分化為毛細胞，但同時啟動的Rb基因調(diào)控的細胞凋亡一定程度上限制了再生。神經(jīng)再支配突出前后受體配體標記物ctbp2、 GluR2的出現(xiàn)為功能恢復(fù)帶來了曙光，但其有序的排列尚需學(xué)者們進一步的研究。雖然各機制均有相應(yīng)的局限性，學(xué)者們在相關(guān)的環(huán)節(jié)均有一定的突破，為毛細胞再生提供了系統(tǒng)完善的可能性。毛細胞再生及功能恢復(fù)這一浩大工程需要全世界科學(xué)家共同探討，相信在不遠的將來會為聽力損害的患者提供行之有效的治療方法。

參 考 文 獻

[1]Forge A, Li L, Corwin JT, et al. Ultrastructural evidence for hair cell regeneration in the mammalian inner ear[J]. Science, 1993,259(5101):1616-1619.

[2]Warchol ME, Lambert PR, Goldstein BJ, et al. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans[J]. Science, 1993,259(5101):1619-1622.

[3]White PM, Doetzlhofer A, Lee YS, et al. Mammalian cochlear supporting cells can divide and trans-differentiate into hair cells[J]. Nature, 2006,441(7096):984-987.

[4]White PM, Stone JS, Groves AK, et al. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals[J]. Dev Biol, 2012,363(1):191-200.

[5]Kawamoto K, Izumikawa M, Beyer LA, et al. Spontaneous hair cell regeneration in the mouse utricle following gentamicin ototoxicity[J]. Hear Res, 2009,247(1):17-26.

[6]Yang SM, Chen W, Guo WW, et al. Regeneration of stereocilia of hair cells by forced Atoh1 expression in the adult mammalian cochlea[J]. PLoS ONE, 2012,7(9):e46355.

[7]Liu Z, Dearman JA, Cox BC, et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression[J]. J Neurosci, 2012,32(19):6600-6610.

[8]Kuo BR, Baldwin EM, Layman WS, et al. In vivo cochlear hair cell generation and survival by coactivation of β-Catenin and atoh1[J]. J Neurosci, 2015,35(30):10786-10798.

[9]Li H, Liu H, Heller S. Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear[J]. Nat Med, 2003,9(10):1293-1299.

[10]Sinkkonen ST, Chai R, Jan TA, et al. Intrinsic regenerative potential of murine cochlear supporting cells[J]. Sci Rep, 2011,1:26.

[11]Hu Z, Luo X, Zhang L, et al. Generation of human inner ear prosensory-like cells via epithelial-to-mesenchymal transition[J]. Regen Med, 2012,7(5):663-673.

[12]Oshima K, Grimm CM, Corrales CE, et al. Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear[J]. J Assoc Res Otolaryngol, 2007,8(1):18-31.

[13]Cox BC, Chai R, Lenoir A, et al. Spontaneous hair cell regeneration in the neonatal mouse cochlea in vivo[J]. Development, 2014,141(4):816-829.

[14]Chai R, Xia A, Wang T, et al. Dynamic expression of Lgr5, a Wnt target gene, in the developing and mature mouse cochlea[J]. J Assoc Res Otolaryngol, 2011,12(4):455-469.

[15]Shi F, Kempfle JS, Edge AS. Wnt-responsive Lgr5-expressing stem cells are hair cell progenitors in the cochlea[J]. J Neurosci, 2012,32(28):9639-9648.

[16]Mellado Lagarde MM, Wan G, Zhang L, et al. Spontaneous regeneration of cochlear supporting cells after neonatal ablation ensures hearing in the adult mouse[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014,111(47):16919-16924.

[17]Liu Z, Fang J, Dearman J, et al. In vivo generation of immature inner hair cells in neonatal mouse cochleae by ectopic Atoh1 expression[J]. PLoS ONE, 2014,9(2):e89377.

[18]Han Z, Yang JM, Chi FL, et al. Survival and fate of transplanted embryonic neural stem cells by Atoh1 gene transfer in guinea pigs cochlea[J]. Neuroreport, 2010, 21(7):490-496.

[19]Zhao LD, Guo WW, Lin C, et al. Effects of DAPT and Atoh1 overexpression on hair cell production and hair bundle orientation in cultured Organ of Corti from neonatal rats[J]. PLoS ONE, 2011,6(10):e23729.

[20]Kirjavainen A, Sulg M, Heyd F, et al. Prox1 interacts with Atoh1 and Gfi1, and regulates cellular differentiation in the inner ear sensory epithelia[J]. Dev Biol, 2008,322(1):33-45.

[21]Kwan T, White PM, Segil N. Development and regeneration of the inner ear cell cycle control and differentiation of sensory progenitors[J]. Ann N Y Acad Sci, 2009,1170:28-33.

[22]Izumikawa M, Minoda R, Kawamoto K, et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals[J]. Nat Med, 2005,11(3):271-276.

[23]Slowik AD, Bermingham-McDonogh O. Hair cell generation by notch inhibition in the adult mammalian cristae[J]. J Assoc Res Otolaryngol, 2013,14(6):813-828.

[24]Li W, Wu J, Yang J, et al. Notch inhibition induces mitotically generated hair cells in mammalian cochleae via activating the Wnt pathway[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2015,112(1):166-171.

[25]Chien WW, Monzack EL, McDougald DS, et al. Gene therapy for sensorineural hearing loss[J]. Ear Hear, 2015,36(1):1-7.

[26]Gorlich A, Wolf M, Zimmermann AM, et al. N-cofilin can compensate for the loss of ADF in excitatory synapses[J]. PLoS ONE, 2011,6(10):e26789.

[27]Jin K, Ren DD, Chi FL, et al. Changes in ADF/destrin expression in the development of hair cells following Atoh1-induced ectopic regeneration[J]. Exp Ther Med, 2013,6(1):177-183.

[28]Namdaran P, Reinhart KE, Owens KN, et al. Identification of modulators of hair cell regeneration in the zebrafish lateral line[J]. J Neurosci, 2012,32(10):3516-3528.

(本文編輯楊美琴)

Recent advances on mammalian hair cell regeneration research

DINGChen-ru,CHIFang-lu.

DepartmentofOtorhinolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,ChinaCorresponding author： CHI Fang-lu, Emai: chifanglu@126.com

【Key words】Cochlea; Hair cell; Regeneration; Precursors; Transcription factor; Gene

【Abstract】The cochlea provide a sense of hearing by converting sound vibration into electrical signals via ciliary movement on the top of hair cells. Ageing, acoustic trauma, environmental chemical toxins, aminoglycosides as well as heritage all contribute to hearing loss and can cause death of mammalian sensory hair cells. Studies show that mammalian hair cell regeneration can be induced through multiple approaches. Here the authors review the recent progress toward the regeneration of inner ear hair cells.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:57-59)

通訊作者：遲放魯(Emai: chifanglu@126.com)

DOI:10.14166/j.issn.1671-2420.2016.01.021

(收稿日期2015-08-10)