周俊，王龍，周芹，熊瓊

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神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1對心肌梗死大鼠缺血心肌Toll樣受體及I型膠原蛋白基因表達的影響

周俊，王龍，周芹，熊瓊

【摘要】目的探討神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(NRG-1)對心肌梗死大鼠缺血心肌Toll樣受體(TLR)及I型膠原蛋白(Col I)基因表達的影響。方法健康雄性SD大鼠15只隨機分為模型組、預(yù)處理組、干預(yù)組3組，每組5只，通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型。模型組不用藥干預(yù)；預(yù)處理組采用尾靜脈給藥的方法給予0.01 μg/g重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(rhNRG-1)，并在給藥后建立心肌梗死模型；干預(yù)組先建立心肌梗死模型，30 min后按0.01 μg/g經(jīng)鼠尾靜脈注射給藥，3組均24 h后處死大鼠取左心室。應(yīng)用RT-PCR檢測梗死區(qū)及其周邊區(qū)TLR mRNA及Col ImRNA表達。結(jié)果模型組、預(yù)處理組、干預(yù)組TLR mRNA的含量分別為0.52±0.29、0.10±0.04、0.30±0.46；Col I mRNA的含量分別為0.81±0.65、1.60±0.41、2.57±1.13；與模型組相比，預(yù)處理組TLR mRNA表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組TLR mRNA含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，干預(yù)組Col I mRNA含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，預(yù)處理組Col I mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相關(guān)性分析表明，Col I mRNA與TLR mRNA表達無明顯相關(guān)性(r=-0.171，P=0.542)。結(jié)論在心肌梗死早期，NRG-1可抑制TLR mRNA的表達，促進Col I的表達，有利于壞死心肌組織的修復(fù)。對于TLR的干預(yù)，在心肌梗死前給予NRG-1的效果優(yōu)于心肌梗死后；對于Col I的干預(yù)，在心肌梗死后給予NRG-1的效果優(yōu)于心肌梗死前。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1；Toll樣受體；I型膠原蛋白；心肌梗死；大鼠

缺血性心肌病的病死率在世界范圍內(nèi)均較高[1]，而心肌梗死中的心肌保護對患者仍是一個挑戰(zhàn)，越來越多的臨床證據(jù)表明，心肌是通過合成各種炎性因子與蛋白來適應(yīng)這種梗死的[2]。

膠原蛋白(collagen，Col)是在所有哺乳動物中都存在的一類纖維狀、大分子蛋白質(zhì)，在哺乳動物體內(nèi)是由結(jié)締組織細胞和其他類型的細胞(如心、肝、肺、脾及腦組織細胞)所分泌的，它們是哺乳動物細胞中最豐富的蛋白質(zhì)，約占整個細胞總蛋白的1/4。心肌梗死后的心肌重構(gòu)與心肌纖維化、心肌肥大有著緊密的聯(lián)系，恰當(dāng)?shù)哪z原蛋白堆積和交聯(lián)對于防止心肌梗死后心肌漸進性重構(gòu)是非常關(guān)鍵的[3]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR) 是固有免疫中的一個成員，存在于人體的各種免疫細胞，如樹突狀細胞、B細胞、單核巨噬細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞及中性粒細胞，以及心、腎、肝等器官中。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(neuregulin-1，NRG-1)是一種由心內(nèi)膜和心肌微血管產(chǎn)生的多肽，它作為一種跨膜蛋白帶有內(nèi)皮生長因子受體結(jié)合域，在蛋白水解酶的作用下可溶的NRG-1從內(nèi)皮細胞中釋放[4]，其通過結(jié)合一系列酪氨酸激酶受體(ErbB2、ErbB3、ErbB4)發(fā)生磷酸化調(diào)控下游信號通路發(fā)揮生物學(xué)活性[5]。NRG-1促進心肌細胞的存活，抑制由血清饑餓、活性氧及阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡[6]。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1保護由缺血再灌注與腎上腺素聯(lián)合引起的心臟損傷，調(diào)節(jié)心臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[7，8]。但是NRG-1是否保護活體中的心肌梗死心臟及機制仍然是不確定的。

鑒于此，我們于2014年11月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院實驗室建立了活體動物的心肌梗死模型，來探索NRG-1在心肌梗死大鼠中對缺血心肌TLR及I型膠原蛋白(Col I)的影響及其可能機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1材料與方法

1.1材料(1)動物：健康雄性SD大鼠15只,體質(zhì)量(275±25)g，清潔級[湖南斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,許可證號:SCXK(湘)2011-0003]。(2)試劑：重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(rhNRG-1，sigma公司生產(chǎn))。(3)儀器：熒光定量PCR儀(7300 Real Time PCR System，ABI);離心機(臺式高速冷凍離心機Neofuge 15R, Heal Force); 超凈工作臺(SW-CJ-1FD, 蘇凈安泰有限公司生產(chǎn))。

1.2方法

1.2.1大鼠分組及心肌梗死模型的建立： 15只SD雄性成年大鼠隨機分為模型組、預(yù)處理組、干預(yù)組，每組各5只。模型組僅建立心肌梗死模型；預(yù)處理組于造模前給予rhNRG-1 0.01 μg/g，經(jīng)鼠尾靜脈注射；干預(yù)組先建立心肌梗死模型，30 min后給予rhNRG-1 0.01 μg/g經(jīng)鼠尾靜脈注射給藥。造模方法：給予1.5%戊巴比妥鈉按30 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉，麻醉成功后仰臥位固定于手術(shù)臺上。分別在四肢皮下將4個針形電極置入，連接6導(dǎo)聯(lián)心電圖機記錄I、II、III、aVL、aVR、aVF導(dǎo)聯(lián)心電圖。在大鼠手術(shù)部位碘伏消毒，鋪無菌洞巾。胸壁左旁正中切開皮膚，行開胸操作，用開胸器撐開肋骨以利于手術(shù)視野充分暴露，以暴露縱隔及心包為度。用眼科剪縱行剪開心包，充分暴露前室間溝及前室間支，即刻用5-0縫線結(jié)扎前室間支中上1/3交界處(在左心耳至心尖的1/2處)。結(jié)扎以下心肌顏色變暗，搏動幅度減弱，心電圖示肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖ST段抬高>2 mm(以心電圖I、II、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段抬高0.2 mV作為手術(shù)成功標(biāo)志)，表明完全結(jié)扎且證明模型成功。心包不縫，逐層關(guān)胸。

1.2.2取材： 模型建立24 h后處死大鼠取左心室，置冰生理鹽水中洗盡血液，剪除左、右心耳及殘余大血管后以濾紙濾干，所有心臟標(biāo)本在長軸中點處垂直于長軸將左心室一分為二，心尖側(cè)一半心肌，沿左室長軸在結(jié)扎點以下中部缺血區(qū)切取含梗死區(qū)及非梗死區(qū)心肌組織放入凍存管中，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3Col I mRNA與TLR mRNA表達檢測： 應(yīng)用RT-PCR方法，采用Invitrogen Biotechnology Co., LTD中國公司合成的引物。Col I mRNA的引物序列為5’-GTCGGAGGAATGGGTGGCTAT-3’，TLR mRNA的引物序列為5’-GCTCTGGCATCATCTTCATTGT-3’。提取組織總RNA，對其進行反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR反應(yīng)，95℃預(yù)變性10 min，95℃延伸15 s，60℃延伸60 s，循環(huán)40次，溶解曲線從75~90℃，每20 s升高1℃，取平均CT值計算2-△CT值，作為各標(biāo)本mRNA的相對表達量，△CT=(目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值)。以β-actin為內(nèi)參照，比較各組Col I mRNA及TLR mRNA表達變化。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1TLR mRNA與Col I mRNA的表達與模型組相比，預(yù)處理組TLR mRNA表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.230，P<0.05)，而干預(yù)組TLR mRNA含量無顯著下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.912，P>0.05)；與預(yù)處理組相比，干預(yù)組差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.358，P>0.05)。與模型組相比，干預(yù)組Col I mRNA含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.306，P<0.05)，而預(yù)處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.549，P>0.05)；與預(yù)處理組相比，干預(yù)組Col I mRNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.435，P>0.05)，見表1。電泳圖見圖1。

表1　3組大鼠TLR及Col I mRNA表達結(jié)果　

注：與模型組比較，aP<0.05

圖1　TLR mRNA與Col I mRNA產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.2TLR mRNA與Col I mRNA的相關(guān)性3組大鼠總體TLR mRNA表達結(jié)果為1.310±1.177，Col I mRNA表達結(jié)果為0.304±0.339，Col I mRNA與TLR mRNA無明顯相關(guān)性(r=-0.171，P=0.542)。

3討論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)在mRNA水平上，心肌梗死24 h內(nèi)，預(yù)處理組應(yīng)用NRG-1對TLR mRNA的表達是抑制的，而干預(yù)組應(yīng)用NRG-1使Col I mRNA的表達量增加。從基因的轉(zhuǎn)錄到翻譯過程中，還會存在各種因素影響mRNA的翻譯和降解，有研究表明miRNA及siRNA在一定程度上通過干預(yù)真核生物合成機制從而參與調(diào)控mRNA的翻譯和降解[9]，故在判斷蛋白質(zhì)功能方面，還需要繼續(xù)測量心肌組織中蛋白質(zhì)的水平。而在給藥時間的選擇上，心肌梗死前給藥對于TLR表達的影響要優(yōu)于心肌梗死后，對于Col I心肌梗死后給藥要優(yōu)于心肌梗死前。

NRG-1是表皮生長因子家族成員之一，目前普遍認為其可激活許多組織類型的增殖、分化和存活，包括乳腺上皮細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和心肌組織[10]。它的生物學(xué)效應(yīng)通過結(jié)合一系列的酪氨酸激酶受體(ErbB2、ErbB3、ErbB4)形成二聚體，從而參與下游信號通路的傳導(dǎo)[11]。NRG-1/ErbB最被人們廣泛知道的是其在心臟和神經(jīng)發(fā)生發(fā)展中的作用，它同時也涉及精神分裂癥和幾種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[12]。事實上，ErbB2(也被稱作為HER-2或者c-neu)首先在許多腫瘤類型頻繁的過表達中被發(fā)現(xiàn)，它只是偶然被發(fā)現(xiàn)是NRG-1參與心力衰竭的證據(jù)。NRG-1在正在生長的心臟和成熟的心臟中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，最初，這些功能僅僅反映在壓力細胞下NRG-1對細胞存活與生長的效應(yīng)中；最近，NRG-1/ErbB系統(tǒng)越來越多的功能被發(fā)現(xiàn)，其中包括心臟迷走神經(jīng)控制系統(tǒng)的交互作用[13]。Col I及III型膠原蛋白(Col III)與高血壓和缺血性心臟病的演變相關(guān)[14]。Col I主要與增加纖維化有關(guān)，這種纖維化可降低心臟順應(yīng)性和損害心臟的收縮和舒張功能，在心肌梗死后，Col III早于Col I存在[15]。TLRs是新近發(fā)現(xiàn)的先天免疫重要的跨膜受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，能夠特異地識別病原微生物，與病原識別模式分子結(jié)合后可通過特異的通路最終導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的激活，引起炎性介質(zhì)的表達，直接影響機體的免疫反應(yīng)強度，并成為聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫的橋梁[16]。截止目前為止共有10種TLR在人體中被發(fā)現(xiàn)，它們分別為TLR-1～TLR-10，其與外來的病原識別并結(jié)合，如革蘭陽性菌的膚聚糖(TLR-2)，病毒雙鏈DNA(TLR-3)，革蘭陰性菌的脂多糖、革蘭陽性菌的磷壁酸(TLR-4)，在固有免疫中扮演著一個非常重要的角色[17，18]。其在哺乳動物中被認為是被自身免疫系統(tǒng)識別的關(guān)鍵成分，它同樣也參與心力衰竭中心臟炎性反應(yīng)的發(fā)生[19]。

Col I在骨骼與結(jié)締組織中發(fā)揮作用的主要方式是形成和保持骨架的完整性，同時其也與心肌梗死后心肌重構(gòu)有密切的關(guān)系，恰當(dāng)?shù)哪z原堆積和連接是預(yù)防心肌漸進性重構(gòu)的關(guān)鍵。在本實驗中，在心肌梗死早期，預(yù)處理組Col I mRNA含量與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而干預(yù)組Col I mRNA含量與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。心肌梗死及心肌缺血均激活炎性細胞浸潤、單核細胞、心肌成纖維母細胞，這些細胞被激活后，存在于細胞間隙中的膠原酶也被激活，使膠原網(wǎng)絡(luò)被降解，Col I同樣也減少[20]。干預(yù)組Col I mRNA較模型組增多，可能是心肌梗死后，給予NRG-1抑制心肌細胞間質(zhì)炎性細胞的浸潤，從而抑制膠原蛋白酶的激活，減少了膠原蛋白的降解。TLRs在人體疾病中的自然免疫和炎性反應(yīng)中扮演著一個重要的角色[21]。Shishido等[22]發(fā)現(xiàn)TLR2在心肌梗死后的心肌重構(gòu)起著重要的作用。Ha等[23]證明TLR2配體通過介導(dǎo)TLR2/PI3K/Akt依賴的機制誘導(dǎo)心肌保護。然而TLR4在心肌梗死缺血后再灌注或未再灌注患者外周血單核細胞中表達均明顯提高，在患者心肌缺血再灌注損傷中，TLR4可能通過TLR4-Myd88依賴的信號通路來激活炎性反應(yīng)，在心肌梗死組心肌中TLR4的表達顯著增加[24]。TLR9配體CpG-C削弱LPS和左前降支冠狀動脈缺血再灌引起的急性心臟功能紊亂[25]。在本實驗中，與模型組相比，在心肌梗死早期，NRG-1預(yù)處理組的TLR mRNA表達明顯減少，而干預(yù)組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能是心肌梗死后，NRG-1激活MEK/ERK及PI3K/Akt通路，抑制TLR4-Myd88依賴的信號通路，抑制梗死區(qū)的炎性因子的釋放及炎性細胞的遷移，從而減慢炎性反應(yīng)的發(fā)展，保護缺血心肌;而干預(yù)組給予NRG-1后與模型組和預(yù)處理組相比，TLR mRNA的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能是由于梗死后心肌炎性反應(yīng)的進展，細胞外基質(zhì)的過度降解，破壞正常區(qū)域的心肌組織結(jié)構(gòu)，此時NRG-1激活MEK/ERK及PI3K/Akt通路受阻，對缺血心肌的保護作用減弱。然而，由于本實驗的標(biāo)本量不大，所測分子通路及mRNA表達的數(shù)據(jù)有限，因此在NRG-1對大鼠心肌梗死心肌中TLR及Col I的作用機制并不能完全闡明，仍需后續(xù)研究及大量的實驗進一步探索其影響機制。

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薈萃分析

絡(luò)病論壇

論著·基礎(chǔ)

Effect of neural regulatory protein 1 on Toll like receptors and type I collagen gene expression in myocardial infarction ratsZHOUJun,WANGLong,ZHOUQin,XIONGQiong.DepartmentofAnesthesiology,theRenminHospitalofWuhanUniversity,HubeiProvince,Wuhan430061,China

Correspondingauthor:WANGLong,E-mail:wanglongwhu@163.com

【Abstract】ObjectiveTo explore the neural regulatory protein-1(NRG-1) influence on the gene expression of myocardial ischemia Toll like receptor(TLR) and type I collagen(Col I)”in rats with myocardial infarction.Methods15 healthy male SD rats were randomly divided into 3 groups, 5 rats in each group. The myocardial infarction model was established by ligation of the anterior descending coronary artery in rats. The model group without drug intervention; pretreatment group via the tail vein medicine to give 0.01 μg/g of recombinant human nueral regulatory protein 1 (rhNRG-1), and in myocardial infarction model was established after administration; intervention group first established model of myocardial infarction, by 0.01 μg/g by the rat tail vein injection, the three groups were sacrificed after 24 h to obtain the left ventricle. Used RT-PCR to detect the expression of TLR mRNA and Col I mRNA in myocardial infarction area and the surrounding area.ResultsModel group, pretreatment group and intervention group's TLR mRNA levels were 0.52±0.29 and 0.10±0.04, 0.30±0.46; Col I mRNA content were 0.81±0.65,0.60±0.41,2.57±1.13; compared with the model group, the pretreatment group's TLR mRNA expression decreased significantly, the difference were statistically significant (P<0.05), the intervention group's TLR mRNA content had no obvious changes, with no statistically significant differences (P>0.05).Compared with the model group,intervention group's Col I mRNA expression increased significantly, and the difference was statistically significant (P<0.05).The pretreatment group content of Col I mRNA did not change significantly, the difference was not statistically significant (P>0.05).Correlation analysis showed that no significant correlation in the expression of Col I mRNA and TLR mRNA(r=-0.171,P=0.542).ConclusionIn the early phase of myocardial infarction,NRG-1 can inhibit the expres-sion of TLR,promote the expression of Col I,help to repair myocardial tissue necrosis.For the intervention of TLR，before the myocardial infarction given NRG-1 in advance is better than that of after myocardial infarction; for the intervention of Col I,after myocardial infarction give，NRG-1 is better than that of before myocardial infarction.

【Keywords】Neural regulatory protein 1; Toll like receptor; Collagen type I; Myocardial infarction；Rats

收稿日期：(2015-05-06)

【DOI】10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.12.022

通信作者：王龍，E-mail:wanglongwhu@163.com

基金項目：作者單位： 430061武漢大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院/武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科