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角蛋白網(wǎng)絡修飾導致毛囊纖維的機械性硬化

生物組織是具有顯著機械特性和彈性模量結構的復合材料，其范圍從幾帕斯卡到幾千兆帕斯卡。有一個研究領域一直致力于從分子水平到細胞和組織水平上了解生物網(wǎng)絡的局部結構和機械特性是如何界定其宏觀結構的。該研究的一種挑戰(zhàn)是，這些網(wǎng)絡的特性必定在長度和力度水平上數(shù)倍超越從整個組織水平轉換至細胞和分子水平（反之亦然）而來的宏觀機械力。

在細胞水平上，過去數(shù)十年見證了由角蛋白、微管和中間絲（IFs）組成的細胞骨架在如何決定細胞機械特性方面的長足進展。對分離細胞的體外研究和在可控性架構和組成的基礎上對生物網(wǎng)絡的體外重組，提高人們對細胞骨架結構方面的認識。然而，這些模型仍然只是近似于大多數(shù)組織復雜的三維結構。在組織水平上，結構各向異性以及各種機械性能不同的成分通常會阻礙網(wǎng)絡結構與機械特性之間的直接相關性。分析模型和計算機模擬可從理論上將網(wǎng)絡的宏觀機械特性與局部網(wǎng)絡結構的參數(shù)連接起來。

在此使用的人體毛囊，展示了三維組織中局部、微觀網(wǎng)絡結構如何與局部機械特性相連接的一種模型系統(tǒng)。毛囊的硬度預計可呈數(shù)量級倍數(shù)的增強，這是由柔軟角質(zhì)形成細胞分化而來的毛發(fā)纖維，其楊氏模量在千兆帕斯卡范圍內(nèi)。在兩個極端之間，中間絲網(wǎng)絡的角化過程使各向同性的細胞基質(zhì)轉變?yōu)槎栊郧腋飨虍愋缘奈镔|(zhì)，連接了從亞細胞水平到組織水平的長度和力度。這種轉變與其他角化結構（如甲和角）的形成以及角質(zhì)層（皮膚的最外側結構）的形成具有相似性。其伴隨著多種生物學過程，如不同角蛋白和角蛋白關聯(lián)蛋白（KAPs）的特異性表達，連同角蛋白網(wǎng)絡的重組和水分丟失一起，導致纖維的壓縮和硬化。然而，盡管一些補充研究對伴隨的角化過程的網(wǎng)絡結構的變化進行了分析，但是對其機械性硬化的結果仍了解甚少。

為此，該研究使用原子力顯微鏡（AFM）沿著毛囊的軸線測量角蛋白結構的硬化，并同時定量局部角蛋白網(wǎng)絡結構和角蛋白超分子結構。

一、材料和方法

詳見原文。

二、結果

毛囊機械力：對取自健康白種人完整毛囊的角蛋白網(wǎng)絡的硬化進行定量。通過冷凍切片獲得縱切面為10 μm厚度的樣本，并將其吸附于載玻片上。為了模擬在體環(huán)境，必須保持高含量的水分以避免組織干燥和萎縮。因此，樣本切開后立即將切片浸沒于PBS溶液中。AFM檢查其具有半徑為納米范圍（r=20～60 nm）的尖端，因此可以對浸沒切片的機械特性進行局部探查。該研究采用了力-容積模式，在10 μm×10 μm區(qū)域內(nèi)通過256等距曲線法記錄力和壓痕深度。使用Hertz模型計算相關彈性系數(shù)。注意，確定的絕對系數(shù)值取決于頂端的形狀和所用的擬合模型；尖端更適于探查深層纖維網(wǎng)絡的局部結構。沿毛囊軸線記錄推算的彈性系數(shù)。一個10 μm×10 μm區(qū)域內(nèi)系數(shù)的離散度大是由樣品納米水平的不均一所致，提示所記錄的力壓痕曲線均值是局部毛囊機械力的代表性測量值

角化過程中網(wǎng)絡結構變化：為了理解所觀察到的毛囊的宏觀硬化如何對應其角蛋白網(wǎng)絡結構中的微觀變化，我們沿著毛囊的軸線記錄其縱切面的形貌學圖像（topographic image）。不同于透射電鏡（TEM）對超薄切片或染色的要求，AFM能夠直接記錄高分辨率的圖像。該圖像是使用AFM的峰值力定量納米結構圖（QNM）模式獲得保留纖維網(wǎng)絡結構的干燥毛囊的形貌學圖。超過170 μm，網(wǎng)絡結構隨角化進程而發(fā)生變化：纖維變得更粗更直且結構更緊密。TEM研究結果與此一致。

半胱氨酸交聯(lián)和（超）分子結構對網(wǎng)絡機械性的影響：生物網(wǎng)絡的機械特性不僅由其幾何因素和纖維密度所決定，還取決于單個纖維的硬度。在距毛囊球部500 μm的硬度曲線拐點κ之上，纖維直徑和方向性的微觀網(wǎng)絡改變減慢。為了更好地了解在拐點κ之后仍然出現(xiàn)的彈性模量的顯著增加，該研究使用X射線微衍射對大纖絲（macrofibrils）的分子結構進行分析。如上所述，分析了兩個毛囊間小角度和大角度X射線衍射（SAXS/WAXS）圖，并得出4個不同角質(zhì)化區(qū)的大致位置。比較同一供體毛囊的結構圖顯示，Ⅰ區(qū)包含無方向性、無定形結構，其發(fā)生5倍硬化。Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)顯示為IF形成、定向，之后縮合成網(wǎng)絡，分別對應10倍增加的彈性模量。Ⅳ區(qū)出現(xiàn)極少的硬化，對應IFs在大纖絲之內(nèi)的最后軸向重排。在分化毛發(fā)內(nèi)的角蛋白纖維含有大量的半胱氨酸殘基。其與富含半胱氨酸的KAPs一起確保了IFs的共價交聯(lián)。X射線衍射證實了晚期毛囊內(nèi)這種逐漸形成的角蛋白-KAPs二硫化物網(wǎng)絡的存在。這些結果表明，半胱氨酸形成和最終的軸向重排與其結構的干燥共同導致了最終的硬化。

為了驗證半胱氨酸交聯(lián)對網(wǎng)絡結構穩(wěn)定性的影響，在DTT還原反應前、后分別探查毛囊的結構。DTT是一種可以破壞半胱氨酸-二硫鍵的還原劑，AFM形貌圖像證實其可以造成大纖絲的膨脹。結果顯示添加DTT并不影響毛囊球部彈性模量的檢測。相反，DTT可以軟化分化毛發(fā)內(nèi)的網(wǎng)絡結構。同一個體內(nèi)DTT處理前、后的系數(shù)比率顯示，半胱氨酸交聯(lián)對沿毛囊軸向的彈性模量的影響呈持續(xù)增加。

三、討論

該研究首次對毛囊內(nèi)整個角質(zhì)化進程中毛發(fā)纖維的漸進性硬化進行檢測，并從機械測量的角度分析微觀網(wǎng)絡結構、局部角蛋白的超分子結構和生物學事件所伴隨發(fā)生的變化。

該研究的AFM和TEM數(shù)據(jù)顯示，各向同性的中間絲（IF）網(wǎng)絡出現(xiàn)在真皮乳頭的上方，位于距毛囊基底部200 μm的伸長區(qū)（Ⅰ區(qū)）內(nèi)。所觀察到的IF網(wǎng)絡的外觀與之前關于角蛋白如K35和K85形成的報告一致，Ⅰ區(qū)早期內(nèi)的高甘氨酸-酪氨酸和高硫KAPs且恰好位于真皮乳頭處。DTT還原實驗顯示，半胱氨酸交聯(lián)在這一階段對其機械特性無顯著的促進作用，進而推測早期KAPs與角蛋白之間的異構肽（γ-谷酰基-∈-賴氨酸）鍵使這種早期網(wǎng)絡結構相當穩(wěn)定，并通過之前確定的轉谷氨酰胺酶3在毛囊基底部的表達和活化發(fā)揮作用。

該研究發(fā)現(xiàn)，從Ⅰ區(qū)開始到Ⅲ區(qū)的末端（距毛球部800 μm），其網(wǎng)絡結構遵循冪次定律呈連續(xù)的機械硬化。在Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)，小的大纖絲呈橫向聚集，導致其直徑逐漸增大進而使IFs形成網(wǎng)絡。而且還出現(xiàn)大纖絲所占容積率的逐漸增加，同時伴有AFM觀察到的微觀網(wǎng)絡的漸進性定向和X射線衍射確定的超螺旋角蛋白圈的漸增性極化?？傊?，這些結果顯示，要形成成熟毛發(fā)的很大一部分蛋白質(zhì)在Ⅱ區(qū)末端被合成大纖絲，通常受調(diào)于轉谷氨酰胺酶為基礎的網(wǎng)絡，這與從Ⅲ區(qū)向前所表達的角蛋白類型缺乏進一步改變的結果一致。該研究能夠通過使用一種各向同性半柔性交聯(lián)三維網(wǎng)絡模型（非仿射纖維彎曲是主要的彈性機制）從理論上模擬Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)內(nèi)的相關機械性硬化。在這種非熱能的網(wǎng)絡中，網(wǎng)絡的篩孔尺寸必須小于纖維持續(xù)長度，后者可以從Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)內(nèi)的大纖絲結構加以推斷。這些非熱能模型通常是纖維組織如膠原，不同于其他用于描述肌動蛋白網(wǎng)絡的模型。

大纖絲的直徑在Ⅱ區(qū)后段（500 μm處）達到最大值，而機械性硬化仍在持續(xù)增強。因此上述模型不能解釋這種持久性硬化，提示有其他附加的因素使其變硬，如漸增的網(wǎng)絡向性及密實性，以及二硫化物交聯(lián)所致大纖絲內(nèi)在的機械強化。大纖絲的內(nèi)在強化可能由KAPs（尤其是超高含硫家族）的連續(xù)合成所驅動，如同原位雜交研究中所示直至Ⅱ區(qū)后段，提示KAPs不斷的融入大纖絲中。與之相符，X射線衍射實驗顯示了在500～700 μm之后，Ⅲ區(qū)內(nèi)KAP/IF類六邊形網(wǎng)絡的逐漸出現(xiàn)和IF內(nèi)部結構的最后成熟。DTT還原實驗證實二硫鍵對整體網(wǎng)絡結構的重要作用在Ⅱ區(qū)內(nèi)已經(jīng)顯現(xiàn)。然而，因為大多數(shù)KAP/IF二硫鍵的構成遠離毛囊（在Ⅳ區(qū)內(nèi)，最早650 μm），所以距離基質(zhì)結構的完成還很遠。因此，這些早期二硫化物主要代表了IF內(nèi)的二硫化物，其促進了大纖絲的整體機械性能。似乎這種IF內(nèi)二硫化物的形成構成了導致毛囊該區(qū)域內(nèi)IF成熟的驅動力。這一結果與某些研究者的近期工作相符，后者提出Ⅲ區(qū)內(nèi)IFs的成熟應該有IF內(nèi)半個半胱氨酸基團相伴，從而能夠完成這種交聯(lián)。

該研究發(fā)現(xiàn)，在IV區(qū)內(nèi)（始于800 μm），毛發(fā)纖維的彈性模量僅為輕度增加（系數(shù)為2）。對于浸沒于PBS內(nèi)的毛囊來說，機械性成熟的完成從1 000 μm處至球部上方。這與緊密壓縮的纖維結構共同提示向延伸為主的網(wǎng)絡結構的轉變。與之相反，Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)的網(wǎng)絡結構以彎曲為主。然而，DTT在1 500 μm處對毛囊機械力的影響是800 μm處的兩倍，證實在網(wǎng)絡結構中的進一步變化。X射線微衍射結果顯示，KAP/IF二硫化物網(wǎng)絡的形成是發(fā)生在800 μm以上僅有的結構重排。KAP/IF二硫化物網(wǎng)絡對毛囊機械力的這種低影響力，盡管其密度超高，很可能是實驗過程中PBS浸沒的結果。由于KAP基質(zhì)的吸濕特性使其在水中會膨脹，而IFs的吸水量極少，從而導致離子與H鍵之間的相互作用減弱。這種膨脹能夠使所測量的基質(zhì)的機械作用減至最小。KAP/IF二硫化物網(wǎng)絡的最后重排與水分的丟失最終確定了毛囊纖維的角化進程。

四、結論

該研究在組織水平上將角蛋白大纖絲結構和分子結構的變化與局部機械性能聯(lián)系在一起。復雜的同步變化（包括大纖絲增厚、纖維定向排列和角質(zhì)化進程）導致毛發(fā)纖維的硬度在短短1 mm內(nèi)增加了3個數(shù)量級。該研究結果與現(xiàn)存的關于毛囊結構和生物學的文獻完全相符，同時與相關結構和機械性能的理論模型兼容。該研究還進一步證實了一種異構肽網(wǎng)絡架構可使早期角蛋白大纖絲穩(wěn)定的假設，并提出此后的一系列二硫化物網(wǎng)絡形成事件。

［陳旭孔佩慧摘自Bornschloql T,Bildstein L,Thibaut S,et al.Keratin network modifications lead to the mechanical stiffening of the hair follicle fiber［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2016,113（21）:5940?5945.DOI:10.1073/pnas.1520302113.］