張旭東　崔大勇　王　新　郭云寶　魯質(zhì)成　張　博

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林　長(zhǎng)春　130021)

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三氧化二砷誘導(dǎo)人腦SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

張旭東崔大勇王新1郭云寶1魯質(zhì)成1張博1

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林長(zhǎng)春130021)

〔摘要〕目的觀察三氧化二砷(As2O3)對(duì)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制的分子機(jī)制。方法在加入SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞As2O348 h后，采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)方法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率；RT-PCR及蛋白免疫印跡(WB)方法，檢測(cè)BAX及Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果As2O3對(duì)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)；BAX mRNA及蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比無(wú)明顯變化(P<0.05)，BAX mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論As2O3通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

〔關(guān)鍵詞〕三氧化二砷;膠質(zhì)瘤；細(xì)胞凋亡

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)血管病外科

第一作者：張旭東(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)血管病的研究。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，其發(fā)病率高，生長(zhǎng)速度快〔1〕。目前，臨床上在進(jìn)行膠質(zhì)瘤治療時(shí)常采用手術(shù)切除為主，放、化療為輔的治療方法。但是，患者在治療后，1年的生存率低于50%，而兩年的生存率更是不及10%。目前研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷(As2O3)不僅可以治療血液腫瘤，還可以對(duì)其他實(shí)體腫瘤有作用，而且關(guān)于As2O3對(duì)人腦SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用也知之甚少。本研究圍繞As2O3誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤(SHG-44)細(xì)胞凋亡的機(jī)制展開(kāi)，為As2O3將來(lái)用于腦內(nèi)膠質(zhì)瘤的臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組實(shí)驗(yàn)中使用的人腦SHG-44細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞研究所提供。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、加As2O31 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L。

1.2儀器與試劑Trizol、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Taq酶及M-MuLV等購(gòu)自寶泰克生物試劑公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司，BAX及Bcl-2單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶羊抗鼠IgG(H+L)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.3MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率將SHG-44細(xì)胞制成1×105/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl。孵育24 h后加入10 μl不同濃度的As2O3，對(duì)照組加生理鹽水。孵育48 h后，各孔加入20 μl 濃度為5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.4RT-PCR將加入As2O348 h后的SHG-44細(xì)胞按說(shuō)明書提取總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及基因片段擴(kuò)增。引物序列：甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'，5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'(452 bp)；Bcl-2：5'-AAC ACC AGA ATC AAG TGT TCG-3'，5'-TCA GGT GGA CCA CAG GTG GC-3'(446 bp)；Bax：5'-AGG GTT TCA TCC AGG ATC GAG C-3'，5'-AGG CGG TGA GGA CTC CAG CC-3'(468 bp)。PCR總反應(yīng)體積為25 μl ,共30個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s)，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，拍照、存盤。

1.5蛋白免疫印跡法(WB)提取各組細(xì)胞的總蛋白，Bio-Rad法測(cè)定各樣本中總蛋白含量。然后40 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗4℃過(guò)夜、洗滌、加入二抗、再洗滌，最后顯色。SHG-44細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(IR)=(1-藥物作用組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.0軟件，組間比較行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同濃度的As2O3對(duì) SHG-44細(xì)胞增殖活性的影響不同濃度的As2O3作用于SHG-44細(xì)胞48 h后，根據(jù)測(cè)得OD值計(jì)算抑瘤率，結(jié)果顯示，As2O3對(duì)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)：1 μmol/L As2O3的IR為(17.63±1.43)%，2 μmol/L時(shí)IR為(30.91±2.93)%，4 μmol/L時(shí)為(36.77±5.35)%，8 μmol/L時(shí)為(50.77±2.81)%。

2.2As2O3對(duì) SHG-44 膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡基因Bax及核蛋白因子Bcl-2 mRNA的影響RT-PCR的電泳結(jié)果顯示，分使用1、2、4、8 μmol/L 的As2O3作用于SHG-44細(xì)胞48 h后，Bax mRNA的表達(dá)含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44細(xì)胞相比沒(méi)有明顯的變化(P>0.05)；而B(niǎo)cl-2 mRNA的表達(dá)含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44細(xì)胞相比，隨著As2O3濃度的增加而減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1，圖2。

圖1　凝膠電泳檢測(cè)SHG-44神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)

圖2　SHG-44神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3As2O3對(duì)SHG-44細(xì)胞凋亡基因Bax及核蛋白因子Bcl-2蛋白的影響分別使用1、2、4、8 μmol/L 的As2O3作用于SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h后，Bax蛋白的表達(dá)含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比沒(méi)有明顯的變化(P>0.05)；而B(niǎo)cl-2蛋白的表達(dá)含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比，隨著As2O3濃度的增加而減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3，圖4。

圖3　SHG-44神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

圖4　SHG-44神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)OD值

3討論

As2O3作為砒霜的主要組成成分，白色粉末，易升華，無(wú)特殊氣味，微溶于水，易溶于堿和酸。《本草綱目》就曾記載使用砒霜等含有砷成分的藥物治療哮喘、梅毒等。1999年通過(guò)了國(guó)家藥品監(jiān)督管理局的審批，臨床上在2000年開(kāi)始作為治療APL而廣泛應(yīng)用〔2〕。本研究結(jié)果表明As2O3對(duì)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴性。

細(xì)胞凋亡指的是由多個(gè)有功能聯(lián)系的基因激活后引起的蛋白表達(dá)以及調(diào)控等的作用引起細(xì)胞程序性的死亡，是所有生命體都具有的一種基本特征。目前研究表明抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用〔3〕，其機(jī)制與影響線粒體的功能結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性〔4～6〕有關(guān)。有報(bào)道指出〔7〕，細(xì)胞凋亡的發(fā)生在一定程度上取決于抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白之間的比例，如Bax/Bcl-2比值高的細(xì)胞，比Bax/Bcl-2比值低的細(xì)胞更易發(fā)生凋亡，相反不易發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明As2O3誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，As2O3在體外可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

4參考文獻(xiàn)

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3Hu RG,Lim J,Donaldson PJ,etal.Characterization of the cystine/glutamate transporter in the outer plexiform layer of the vertebrate retina〔J〕.Eur J Neurosci,2008;28(8):1491-502.

4Pacitti D,Wang T,Page MM,etal.Characterization of cytosolic glutathione peroxidase and phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and their modulation by in vitro selenium exposure〔J〕.Aquat Toxicol,2013;130-1:97-111.

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〔2015-03-21修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：張博 (1981-),男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)血管病的研究。

〔中圖分類號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6358-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.018