辛寶林 于秀坤

(大慶市疾病預防控制中心，黑龍江 大慶 163311)

細胞免疫檢測試驗在結核病中的診斷價值

辛寶林 于秀坤

(大慶市疾病預防控制中心，黑龍江 大慶 163311)

目的評估細胞免疫檢測試驗在結核病中的診斷價值。方法 研究對象來自于2013年2月至2015年5月于我中心就診的疑似結核病患者66例。取患者晨起喉深部痰液用于涂片法和羅氏固體培養(yǎng)法，取患者晨起肘靜脈血5 mL用于細胞免疫檢測試驗。以羅氏固體培養(yǎng)法結果為參照。分析3種檢查結果的一致性。結果 細胞免疫檢測試驗的靈敏度為94.59%、特異度為100%、準確度為96.97%。涂片法免疫檢測試驗的靈敏度為64.86%、特異度為86.21%、準確度為74.24%。細胞免疫檢測試驗準確度高于涂片法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 細胞免疫檢測試驗的準確性高，優(yōu)于涂片法，可作為結核病早期診斷可靠的檢測手段。

細胞免疫檢測試驗；結核病；結核分枝桿菌；涂片法；羅氏固體培養(yǎng)法

結核病是結核分枝桿菌感染導致局部組織變性壞死并引發(fā)一系列的免疫反應的疾病，該病傳染性高，單因素致死率高，嚴重威脅著人類健康。我國是結核病高負荷國家，2010年調查數據顯示，我國活動性肺結核患者523萬，年發(fā)病人數130萬，居世界第二位，僅次于印度[1]。近年來，結核病的早期確診成為研究熱點，實驗室檢測方法分為細菌學、血清學、分子生物學和細胞免疫學等[2]。細菌學和血清學手段準確性差，而分子生物學技術費用昂貴，細胞免疫學方法則成為結核病診斷新的選擇。本研究觀察了細胞免疫檢測試驗診斷結核病的準確性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本來源：研究對象來自于2013年2月至2015年5月于我中心就診的疑似結核病患者66例，其中男38例、女28例，年齡19～55歲，平均年齡（33.7±7.4）歲，病程1個月～2年。血樣本用肝素鋰抗凝的真空采血管取患者晨起肘靜脈血5 mL應用于細胞免疫檢測試驗。痰樣本取患者晨起喉深部痰分為2份用于羅氏固體培養(yǎng)法和涂片法。

1.2 細胞免疫檢測試驗：血樣本需在4 h內送檢。將等體積的RPMI1640培養(yǎng)液和等體積的Ficoll淋巴細胞分離液上層與血樣本混勻，溫度設置為18 ℃，以1000 r/min的速度離心20 min。分離中層單個核細胞，放入新的15 mL無菌離心管中，加RPMI1640培養(yǎng)液使液體總體積至10 mL，再將單個核細胞洗掉，溫度設置為18 ℃，以600 r/min的速度離心7 min，將上清液棄掉。取AIM-V培養(yǎng)液1 mL重懸細胞，等細胞沉淀后繼續(xù)AIM-V培養(yǎng)液使液體總體積至10 mL，溫度設置為18 ℃，以350 r/min的速度離心7 min，將上清液棄掉。獲得的稀釋細胞工作液濃度為2.5×102個/μL。在抗原A孔中加入ESAT-6抗原50 μL，抗原B孔中加入CFP-10抗原50 μL，陰性對照孔中加入AIM-V細胞培養(yǎng)液50 μL陽性對照孔中植物血凝素50 μL。在上述4孔中各加入制備好的稀釋細胞工作液100 μL。培養(yǎng)箱溫度設置為37 ℃，二氧化碳濃度為5%，孵育20 h。將抗原致敏效應T淋巴細胞洗滌去，加入生物素標記的二抗后酶聯顯色。結果為陽性判讀應符合下列情況之一：空白對照孔內斑點數＜6時，而其他3孔中任意一孔斑點數－空白對照孔內斑點數≥6；空白對照孔內斑點數≥6時，而其他3孔中任意一孔斑點數2倍于空白對照孔內斑點數。

1.3 羅氏固體培養(yǎng)法：將等體積的4%氫氧化鈉溶液加入到痰樣本中，渦旋振蕩器震蕩20 s，室溫下靜置15 min后，接種0.1 mL樣本于培養(yǎng)基斜面上，放置于培養(yǎng)箱中37 ℃下孵育。接種3周后開始觀察，每周一次，8周內發(fā)現菌落生長則為陽性。

1.4 涂片法：將等體積的4%氫氧化鈉溶液加入到痰樣本中，采用渦旋振蕩器震蕩20 s使其均勻化，室溫下靜置15 min。取痰樣本于玻片正面的靠右端2/3處中央涂抹卵圓形痰膜，自然干燥，紫外線燈下照射持續(xù)30 min～1 h，微火固定，滴加0.8%石碳酸復紅溶液，微火加熱5 min，細流水洗去染色劑，瀝干水分。于痰膜上端外緣滴3%鹽酸乙醇溶液脫色瀝干水分，再次用細流水洗去脫色劑，瀝干水分。然后用0.1%亞甲藍溶液復染，30 s后用細流水洗去復染劑，瀝干水分，涂片自然干燥后鏡檢。紅色為陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析：所有數據均采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件整理統(tǒng)計。以羅氏固體培養(yǎng)法結果為參照，計算細胞免疫檢測試驗和涂片法的靈敏度、特異度和準確度。準確度比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

羅氏固體培養(yǎng)法結果為陽性56.06%（37/66），陰性44.94%（29/66）。細胞免疫檢測試驗結果為陽性53.03%（35/66），陰性46.97%（31/66）。涂片法結果為陽性42.42%（28/66），陰性57.58%（38/66）。細胞免疫檢測試驗的靈敏度為94.59%（35/37）、特異度為100%（29/29）、準確度為96.97%（64/66）。涂片法免疫檢測試驗的靈敏度為64.86%（24/37）、特異度為86.21%（25/29）、準確度為74.24%（49/66）。細胞免疫檢測試驗準確度高于涂片法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

ESAT-6為結核分枝桿菌分泌的6-kDa早期分泌靶蛋白，由RD-1區(qū)RV3875基因編碼，抗原性和免疫原性強[3]，可調節(jié)固有免疫反應的細胞功能，并為結核分枝桿菌特異性抗原。CFP-10為結核分枝桿菌R3874基因編碼，也屬于為結核分枝桿菌特異性抗原。ESAT-6和CFP-10與大多數非結核分枝桿菌不存在抗原交叉。細胞免疫檢測試驗是采用ESAT-6和CFP-10作為刺激原，刺激與結核分枝桿菌相關的效應T淋巴細胞分泌細胞因子，然后再與相應酶標記抗體結合聯動顯色底物發(fā)生反應，顯色底物在反應部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑點[4]。試驗結果為陽性時所顯示的斑點則為與結核分枝桿菌相關的效應T淋巴細胞。同時采用兩種抗原可改善單一抗原不能包含所有表位的局限性，提高結核病診斷敏感性[5]。細胞免疫檢測試驗具有操作簡單、周期短、敏感度和特異度高等優(yōu)點[6]。

本研究結果顯示細胞免疫檢測試驗的靈敏度為94.59%、特異度為100%、準確度為96.97%。細胞免疫檢測試驗準確度高于涂片法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示細胞免疫檢測試驗的準確性高，優(yōu)于涂片法，可作為結核病早期診斷可靠的檢測手段。

參考文獻

[1] 王玲玲,李輝,謝風.結核分枝桿菌幾種臨床檢測方法的比較[J].中國實驗診斷學,2013,17(11):1992-1995.

[2] 藏旭斌,張萌,寧永忠.診斷結核病的實驗室技術現狀[J].中國現代醫(yī)藥雜志,2014,16(8):102-104.

[3] 趙青,馮國棟,王雯菁,等.結核分枝桿菌及抗原ESAT-6、Ag85B對中性粒細胞白三烯B4表達的影響[J].醫(yī)學研究雜志,2015,44(5):20-24.

[4] 劉幸福,蘇惠青,羅宏.結核感染T細胞斑點檢測在綜合醫(yī)院應用評價[J].實用醫(yī)技雜志,2015,22(5):522-523.

[5] 陳翠翠,葉娟,趙俊偉,等.復合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活動性肺結核輔助診斷中的價值[J].鄭州醫(yī)科大學(醫(yī)學版),2014,49 (2):211-214.

[6] 劉紅,黃永杰,王靜,等.結核感染T細胞斑點試驗在疑似結核病患者診斷中的價值研究[J].中華結核和呼吸雜志,2014,37(3):192-196.

R52

B

1671-8194（2016）36-0129-02