王煥軍

(山東省諸城市諸城畜牧獸醫(yī)管理局,山東諸城　262200)

犬附紅細(xì)胞體的病原學(xué)特性研究進(jìn)展

王煥軍

(山東省諸城市諸城畜牧獸醫(yī)管理局,山東諸城262200)

近年來(lái)隨著養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展,犬附紅細(xì)胞體的發(fā)病日益增多,不但影響家庭寵物犬的養(yǎng)殖,更給規(guī)?；B(yǎng)犬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.犬附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體引起的一種人畜共患傳染病,犬類(lèi)感染附紅細(xì)胞體后在非應(yīng)急狀態(tài)下一般呈隱形感染,很少表現(xiàn)臨床癥狀,臨床上往往與弓形體、犬瘟熱等病混同,從而貽誤治療時(shí)機(jī),本文從其病原學(xué)研究進(jìn)展入手,以期提高對(duì)該病的認(rèn)識(shí)和了解。

1　分類(lèi)

目前,附紅細(xì)胞體的歸類(lèi)尚未明確,《伯吉氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》將其歸于立克次氏體目,無(wú)漿體科,附紅細(xì)胞體屬,屬細(xì)菌類(lèi).后有研究認(rèn)為附紅細(xì)胞體與支原體類(lèi)似,應(yīng)列入柔膜體綱支原體屬,也有學(xué)者通過(guò)對(duì)犬附紅細(xì)胞體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)犬附紅細(xì)胞體具有多形性,含有dNA和RNA結(jié)構(gòu),直徑在0.3～2.0μm之間,為一單層限制性膜包裹的圓形結(jié)構(gòu),無(wú)明顯的細(xì)胞器,無(wú)核樣結(jié)構(gòu),證實(shí)附紅細(xì)胞體為典型的原核生物.鑒于其分類(lèi)的不明確性,很多學(xué)者建議應(yīng)測(cè)定整個(gè)附紅細(xì)胞體基因組序列,結(jié)合其他生物學(xué)特性確定其種屬分類(lèi)地位。

2　形態(tài)結(jié)構(gòu)與染色特性

據(jù)掃描電鏡觀察,附紅細(xì)胞體可附于紅細(xì)胞表面,也可游離于血漿中,每個(gè)紅細(xì)胞表面可附有一個(gè)或多個(gè)不等的附紅細(xì)胞體,單個(gè)附紅細(xì)胞體可表現(xiàn)球狀、餅狀、卵圓形等多種形態(tài),包裹于一層限制性膜,無(wú)細(xì)胞壁和細(xì)胞核.感染附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞不再呈現(xiàn)雙面凹的圓餅狀,而是表現(xiàn)為表面粗糙的不規(guī)則形體,例如波浪狀、星芒狀、鋸齒狀。

附紅細(xì)胞體易被苯胺類(lèi)色素染色,革蘭氏染色結(jié)果為陰性;瑞氏染色中,紅細(xì)胞上出現(xiàn)深藍(lán)色小體的為陽(yáng)性,瑞士染色簡(jiǎn)單快速,但染色液中經(jīng)常出現(xiàn)染色顆粒影響結(jié)果觀察;姬姆薩氏染色中,紅細(xì)胞上出現(xiàn)藍(lán)紫色小體者為陽(yáng)性,姬姆薩氏染色著色效果好,但是染色所需時(shí)間長(zhǎng)且染色過(guò)程中易受染色液pH值變化的影響;吖啶橙染色過(guò)程稍復(fù)雜,熒光顯微鏡下觀察,在紅細(xì)胞邊緣出現(xiàn)淡綠色熒光小體者為陽(yáng)性,但吖啶橙染色時(shí)核仁和核碎片也可發(fā)出熒光,易出現(xiàn)假陽(yáng)性.有研究證實(shí),吖啶橙的檢出率最高,甚至在被感染紅細(xì)胞發(fā)生形體變化之前即可檢出,而其他染色方法要在紅細(xì)胞變形后才能檢出附紅細(xì)胞體.在所有姬姆薩染色檢測(cè)為陽(yáng)性的病例,用吖啶橙染色時(shí)均為陽(yáng)性,而部分姬姆薩和瑞氏染色檢測(cè)為陰性的病例中用吖啶橙染色仍為陽(yáng)性,說(shuō)明吖啶橙染色是較敏感的檢測(cè)方法,但在實(shí)際應(yīng)用中我們要考慮到染色顆粒附著帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題,對(duì)于臨床中遇到的有爭(zhēng)議的病例,也可采用特異性好、敏感性高的PCR等檢測(cè)技術(shù)予以確認(rèn)。

3　理化特性

犬附紅細(xì)胞體對(duì)各種理化因素敏感,抵抗力較弱,耐低溫不耐高溫,低溫(如-30℃)情況下部分附紅細(xì)胞體可存活4個(gè)月之久,也有人報(bào)道在-70℃條件下,可保存數(shù)年,而在75℃～100℃的水浴條件下,只需30s～1min,即被全部滅活;在含氯的消毒劑中只需要作用1min,就會(huì)被全部滅活;在0.1%的碘液中會(huì)立即停止活動(dòng),而附紅細(xì)胞體在1%鹽酸或者5%醋酸溶液中會(huì)提高運(yùn)動(dòng)活性,此特征具有鑒別意義。

4　培養(yǎng)特性

附紅細(xì)胞體分離培養(yǎng)比較困難,因其以紅細(xì)胞作為生長(zhǎng)載體,屬于細(xì)胞依賴(lài)性體外培養(yǎng),且缺乏切實(shí)有效地分離培養(yǎng)手段,這也是針對(duì)附紅細(xì)胞體的研究較為緩慢的原因.國(guó)外有學(xué)者通過(guò)試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)感染附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量增加,觀察到附紅細(xì)胞體在生長(zhǎng)過(guò)程中要消耗葡萄糖,并指出附紅細(xì)胞體可能是通過(guò)糖酵解的方式代謝葡萄糖,最終生成乳酸。

華修國(guó)等用血液普通肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)犬附紅細(xì)胞體,結(jié)果均為陰性;張守法等用RPMI-1640、M-199、D-MEM3種培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液,再分別按體積分?jǐn)?shù)加入400 ml/L的犢牛血清配成3種完全培養(yǎng)基,并按體積分?jǐn)?shù)為1%的比例向完全培養(yǎng)基中添加100mg/mL的卡那霉素,37℃恒溫培養(yǎng)牛附紅細(xì)胞體獲得成功,其中在RPMI-1640培養(yǎng)基中,每12 h更換一次培養(yǎng)液,并補(bǔ)充適量正常紅細(xì)胞,獲得了99%的感染率,連續(xù)傳代培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)22d;李曉云等選用添加新生牛血清、酵母浸出液、葡萄糖等成分的PPLO肉湯,將受感染紅細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),定期更換培養(yǎng)液,除首次接種外不添加任何紅細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)達(dá)280d以上,染蟲(chóng)率維持近100%。

5　抗原特性

針對(duì)犬附紅細(xì)胞體抗原特性研究較少,有研究對(duì)犬附紅細(xì)胞體進(jìn)行體外培養(yǎng),培養(yǎng)后對(duì)解離的犬附紅細(xì)胞體經(jīng)超聲波裂解,制備粗提抗原并提純,對(duì)所提抗原進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析.在電泳圖譜上出現(xiàn)了3條主蛋白帶,其分子量分別為66、32和25KD,其中32和25KD的抗原具有較好的免疫性,且不與犬附紅細(xì)胞體陰性血清發(fā)生交叉反應(yīng),具有較好的特異性,這可能與附紅細(xì)胞體的種屬特異性有關(guān)。

6　小結(jié)

目前,國(guó)內(nèi)犬附紅細(xì)胞體的研究較少,且缺乏研究深度.其病原學(xué)分類(lèi)、附紅細(xì)胞體生活史、傳播途徑、發(fā)病機(jī)理等都有待進(jìn)一步研究,加之在臨床上其發(fā)病多呈隱形感染,缺乏足夠的重視,導(dǎo)致了該病的進(jìn)一步蔓延,該病在防控上也無(wú)特效藥和疫苗,只能根據(jù)臨床表現(xiàn)進(jìn)行對(duì)癥治療,而且在停藥后易復(fù)發(fā).針對(duì)抗原特異性的研究,可能會(huì)對(duì)抗原特性的深入研究以及高效疫苗甚至基因工程疫苗的研制奠定一定基礎(chǔ)。