于新友，李天芝，高 鵬，王金良(.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 56600；.濱州市科學(xué)技術(shù)局，山東 濱州 56600；.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 56600)

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檢測方法豬偽狂犬病毒分子生物學(xué)檢測方法研究進(jìn)展

于新友1，李天芝1，高 鵬2，王金良3
(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.濱州市科學(xué)技術(shù)局，山東 濱州 256600；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

摘 要：通過綜述豬偽狂犬病病毒分子生物學(xué)檢測方法，主要包括核酸探針、常規(guī)PCR方法、套式PCR方法、多重PCR方法、熒光定量PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增等6種方法，希望對豬狂犬病病毒病防控有一定的參考價值。

關(guān)鍵詞：豬狂犬病病毒；分子生物學(xué)；檢測方法

偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)是引起牛、羊、豬、犬和貓等多種家畜和野生動物發(fā)熱、奇癢(除豬外)和急性腦脊髓炎等為主要癥狀的皰疹病毒，由該病毒引起的疾病癥狀似狂犬病，故稱為偽狂犬病。1702年由匈牙利學(xué)者Aladar Aujeszky首次報道本病，目前該病在世界上50多個國家和地區(qū)范圍廣泛分布。豬是PRV的貯存宿主和傳染源，健康豬與患豬、帶毒豬直接接觸可感染該病。主要引起母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、死胎和產(chǎn)弱仔，初生仔豬表現(xiàn)為腹瀉及神經(jīng)癥狀，感染率和死亡率可達(dá)100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。分子生物學(xué)檢測方法以檢測快度、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌和病毒病的檢測，并展示良好的應(yīng)用前景。筆者就目前國內(nèi)外PRV檢測的分子生物學(xué)方法的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為豬偽狂犬病的防控提供參考。

1 核酸探針

核酸探針又稱核酸雜交，利用核苷酸堿基順序互補(bǔ)的原理，用特異的基因探針即識別特異堿基序列（靶序列）的有標(biāo)記的一段單鏈DNA(或RNA)分子，與被測定的靶序列互補(bǔ)，以檢測被測靶序列的技術(shù)。魏偉等[1]用光敏生物素標(biāo)記PRV特異性糖蛋白gP50基因中的222 bp片段和重組子pup制備的探針，分別檢出了46.8 pg和93.6 pg的PRV DNA，且pup探針只與PRV呈雜交陽性，建立了PRV核酸探針檢測技術(shù)。郭萬柱等[2]用P32標(biāo)記的PRV基因組DNA或克隆片段對病毒DNA和感染豬組織DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，結(jié)果檢出了10 pg的病毒DNA。劉志杰等[3]通過PCR擴(kuò)增了一段304 bp的豬偽狂犬病毒gE基因片段，將其作為核酸探針來對PRV野毒株進(jìn)行檢測。經(jīng)試驗(yàn)證明該探針只與同源DNA出現(xiàn)陽性雜交信號，而與PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA的雜交結(jié)果均為陰性，具有良好的特異性，敏感性檢測結(jié)果表明，該探針最低可檢出4 pg的同源DNA，具有很高的靈敏度。

2 常規(guī)PCR 方法

PCR方法是根據(jù)目的片段設(shè)計引物，借助儀器和DNA聚合酶體外大量擴(kuò)增部分或全部目的片段，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。董浩等[4]建立了豬偽狂犬病毒疫苗株與野毒株鑒別PCR檢測方法，結(jié)果顯示，該法可對PRV Fa野毒株擴(kuò)增出354 bp、237 bp的2條核酸酸片段，從PRV Bartha-K61疫苗株僅擴(kuò)增出1條237 bp的片段，對PCV2、PPV、CSFV、PRRSV的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。張婕等[5]根據(jù)已發(fā)表的豬偽狂犬病病毒gE基因核酸序列，設(shè)計合成1對引物，擴(kuò)增片段長度為276 bp，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立檢測PRV野毒的PCR方法，利用建立的PCR方法檢測疑似PRV野毒感染的臨床送檢組織病料34份，陽性樣品18份，陽性率達(dá)52.94% (18/34)。王香玲等[6]根據(jù)豬偽狂犬病毒(PRV) gE基因序列保守區(qū)段，設(shè)計一對特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了可區(qū)分豬偽狂犬病毒野毒株與基因缺失疫苗株的PCR檢測方法，并對該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，該P(yáng)CR方法可擴(kuò)增出388 bp的目的片段，對模板的最低檢測量為1.1 pg，與豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬細(xì)小病毒、豬支原體、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒無交叉反應(yīng)，具有高特異性。

3 套式PCR方法

套式PCR方法是設(shè)計內(nèi)外2種引物，同時擴(kuò)增2次，該法能節(jié)省模板，且敏感性較高。張志等[7]建立了能夠特異性檢測PRV野毒株的套式PCR方法。與常規(guī)PCR相比，該方法檢測極限可達(dá)10個病毒拷貝/μL，是常規(guī)PCR的1 000倍，并與豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒等不存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象。在對臨床150份樣品檢測時，套式PCR的陽性率為21.33%，常規(guī)PCR的陽性率為10%。

4 多重PCR方法

多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或多種病原核酸，它具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)廣泛用于各種臨床疾病的快速診斷。趙緒永等[8]建立檢測PRV，PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法，并對其敏感性、重復(fù)性和特異性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，該法具有高度特異性，與其他病原無明交叉反應(yīng)，檢測靈敏度高，可檢出1.0×101拷貝/μL的陽性質(zhì)?；?TCID50/mL的病毒樣品。韓勇[9]建立了一種同時檢測PPV 和PRV的二重PCR方法，對PPV和PRV擴(kuò)增片段大小分別為942bp和485 bp的片段，特異性試驗(yàn)表明，對其他幾種病原的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該二重PCR能檢出 PPV和PRV最低濃度分別為22、11.7 pg/L。程亮亮等[10]根據(jù)GenBank中登錄的HP-PRRSV Nsp2基因缺失區(qū)和PRV gB基因保守區(qū)序列，分別設(shè)計并合成兩對特異性擴(kuò)增引物，通過對反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了能夠同時檢測HP-PRRSV和PRV的雙重PCR診斷方法。利用建立的雙重PCR方法對30份臨床可疑樣品進(jìn)行檢測，并與商品化單項(xiàng)PCR試劑盒進(jìn)行對比驗(yàn)證。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法具有較高的靈敏度和特異性，與商品化單項(xiàng)PCR試劑盒檢測結(jié)果完全一致。王隆柏等[11]建立了能同時擴(kuò)增CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV等5種病毒的多重PCR方法。結(jié)果顯示，該法對CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV5種病毒的檢測敏感性分別為220、1.6、72、400和370 pg，特異性結(jié)果顯示，該法對SIV、JEV、SS、PEDV擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，特異性好。謝燕婷等[12]利用PRV gB基因、PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計，建立了PRV、PCV2、PPV多重PCR檢測方法，該法對3種病毒的檢測靈敏度分別為1.62×10-6、1.47×10-6和1.28×10-4ng，對PRRSV和CSFV的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。顧陽等[13]根據(jù)豬偽狂犬病病毒（PRV）gE、gH基因序列，設(shè)計合成了2對特異性引物，通過對PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，建立了鑒別PRV強(qiáng)毒和疫苗毒的雙重PCR檢測方法，即利用一次PCR反應(yīng)，從強(qiáng)毒株基因組中可同時擴(kuò)增出2條大小分別為429 bp(gE基因)，355 bp (gH基因)的特異性片段，從弱毒株DNA中僅擴(kuò)增出1條大小為355 bp的片段，而豬圓環(huán)病毒2型和豬細(xì)小病毒 DNA擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。敏感性試驗(yàn)表明，所建立的雙重PCR檢測方法最低有效檢測量為1×102TCID50/0.1 mL。王洪光等[14]建立了可同時檢測豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）與豬細(xì)小病毒(PPV)的多重PCR方法，結(jié)果顯示，擴(kuò)增的目的片段大小分別為192 bp（PRV）、255 bp（PCV2）和759 bp（PPV）。對PRV、PCV2 和PPV的核酸檢測最低濃度分別為：2.5×10-2、2.2×10-3和3.7×10-2ng。

5 熒光定量PCR方法

熒光定量PCR技術(shù)是指采用熒光探針或SYBR GreenⅠ熒光染料通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)弱的變化來測定特異性產(chǎn)物的量，不需要分離PCR產(chǎn)物，即能準(zhǔn)確定量起始模板數(shù)。且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)。呂素芳等[15]建立了檢測偽狂犬病毒(PRV) gE基因缺失病毒株SYBR Green I實(shí)時定量PCR方法，該法的檢測靈敏度為1.75×103拷貝/μL，比傳統(tǒng)PCR方法高100倍，對PCV2、PPV、CSFV、PRRSV檢測結(jié)果均為陰性，具有良好的特異性和重復(fù)性。鄭敏等[16]建立了可區(qū)分豬偽狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法，同時驗(yàn)證該方法的特異性、敏感性、重復(fù)性。結(jié)果顯示，該法檢測靈敏度為2.23×10拷貝/μL，比常規(guī)PCR檢測方法高100倍，與PCV2、CSFV、PRRSV、PPV均無交叉反應(yīng)，具有高特異性。余波等[17]建立了豬PRV SYBR Ureen I實(shí)時熒光定量PCR診斷方法，研制診斷試劑盒。擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析結(jié)果顯示只出現(xiàn)單特異峰，無引物二聚體，對豬PCV2、PPV、PRV gE基因缺失株、豬源E.coli、CSFV、PRRSV均無陽性信號擴(kuò)增，且重復(fù)性好，靈敏度可達(dá)2.3×101拷貝/μL。田云等[18]根據(jù)偽狂犬病病毒gE基因的序列，設(shè)計和合成了一對特異的可用于檢測偽狂犬病病毒野毒的PCR引物和一條Taqman。熒光探針，采用熒光定量PCR儀，建立了一種可實(shí)時定量檢測偽狂犬病病毒野毒的熒光定量PCR技術(shù)。該方法的線性范圍為1.0×102～1.0×1010拷貝，靈敏度可達(dá)4拷貝。對偽狂犬病gE基因缺失疫苗、豬細(xì)小病毒和鴨瘟病毒擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。鄭蘭蘭等[19]建立了同時檢測檢測豬偽狂大病毒與豬圓環(huán)病毒2型二重SYBR Green Ⅰ實(shí)時熒光PCR方法，結(jié)果顯示，PCV2與PRV熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線的Tm值分別為80.8 ℃和86.7 ℃，熔解曲線特異，靈敏度分別可達(dá)215拷貝/μL 和180拷貝/μL，是普通PCR檢測方法的100倍。

6 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法(LAMP)是一種新興的分子生物學(xué)檢測方法，已廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌病和病毒病的檢測。以操作簡單、檢測速度快、敏感性好、特異性高等優(yōu)勢適合基層部門應(yīng)用。楊睿等[20]根據(jù)PRV gE基因的保守序列，應(yīng)用Primer Explorer V4軟件，設(shè)計合成了一套LAMP引物，經(jīng)過反應(yīng)體系與反應(yīng)時間的優(yōu)化，建立了PRV的可視化LAMP快速檢測方法。該方法最低可檢測出質(zhì)量濃度為6.2×10-9mg/L的病毒DNA含量，靈敏度為普通PCR的100倍，而且特異性好，能夠區(qū)別偽狂犬病野毒與gE基因缺失疫苗毒。該方法反應(yīng)快速，只需要40 min就能檢測出結(jié)果，操作簡單，不需要PC R儀等復(fù)雜的儀器，為偽狂犬病的快速診斷提供了新的思路。張莉等[21]針對豬偽狂犬病病毒gE基因保守區(qū)域設(shè)計并合成了4條引物，建立了偽狂犬病病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法，并進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該方法可特異性地檢測豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株①，不能檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒和豬偽狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株，該方法的最低檢測量可達(dá)100個拷貝質(zhì)粒DNA，比常規(guī)PCR方法的敏感性高10倍。王樹芬等[22]設(shè)計并合成3對LAMP引物，以羅丹明B衍生物作指示劑(該指示劑在反應(yīng)前加到反應(yīng)緩沖液里)，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了可視化LAMP快速檢測PRV的方法，該法在63 ℃恒溫反應(yīng)40 min可得到肉眼可視結(jié)果，顏色變成藍(lán)色判定為陽性，仍然保持紫色判定為陰性。

7 小結(jié)與展望

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各國專家、學(xué)者先后建立了多種PRV分子生物學(xué)檢測方法，但這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如常規(guī)PCR方法、套式PCR方法和多重PCR方法雖然檢測簡單、快速、方便但不能精確定量，且敏感性有限，容易漏檢。熒光定量PCR技術(shù)彌補(bǔ)了常規(guī)PCR方法的缺點(diǎn)，但由于所用儀器和試劑價格昂貴，成本高，且對操作人員有很高的要求，不利于其在基層獸醫(yī)部門大規(guī)模推廣應(yīng)用。LAMP方法是一種新興的方法，不需要特殊的儀器設(shè)備，操作簡便，但敏感性太高，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，且單獨(dú)使用任何一種方法都很難正確診斷該病，最好將各種方法結(jié)合起來，綜合判斷，不同單位可根據(jù)自身的情況選擇適合的方法，相信隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，將會有更多的新型分子生物學(xué)診斷方法建立，從而為豬偽狂犬病的診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查和防控提供保障。

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(收稿日期：2015-08-09)

作者簡介：于新友(1983-)，男，漢族，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術(shù)研究.Email：yuxinyou_2006@126.com

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-011-14)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2012CQ012)；山東省技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目(201220916006)