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      納米顆粒技術(shù)及其在豬病防治中的應(yīng)用進(jìn)展

      2016-01-31 06:40:47莊金秋梅建國姚春陽山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院山東濱州56600黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局山東青島66555
      豬業(yè)科學(xué) 2016年1期
      關(guān)鍵詞:豬病防治進(jìn)展

      莊金秋,梅建國,張 倩,姚春陽,李 峰(.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東 濱州 56600;.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東 青島 66555)

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      納米顆粒技術(shù)及其在豬病防治中的應(yīng)用進(jìn)展

      莊金秋1,梅建國1,張 倩2,姚春陽1,李 峰1
      (1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東 濱州 256600;2.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東 青島 266555)

      摘 要:納米顆粒技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用于運(yùn)載多肽蛋白類藥物、輸送免疫調(diào)節(jié)劑、輸送疫苗等,具有良好的應(yīng)用前景。該技術(shù)在豬病防治中也已被廣泛用于疾病診斷、預(yù)防、監(jiān)測(cè)以及治療等方面。通過綜述近年來納米顆粒技術(shù)的最新研究進(jìn)展,以期為臨床更好的防治豬病提供參考。

      關(guān)鍵詞:納米顆粒;豬?。环乐?;進(jìn)展

      納米顆粒是用納米級(jí)粒子制成的、粒徑在10~100 nm范圍內(nèi)的超微粒子。納米顆粒具有比表面積大、表面活性中心多、反應(yīng)活性高、吸附和催化能力強(qiáng)的特點(diǎn),可作為活性組分(藥物、活性分子、基因、疫苗等)的載體,通過緩釋、靶向輸送、提高組分穩(wěn)定性等方式,延長活性組分在體內(nèi)的半衰期,并增強(qiáng)其活性。納米顆粒技術(shù)自誕生以來,就因其特殊功效而備受矚目,成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn),具有良好的應(yīng)用前景。

      1 納米顆粒技術(shù)

      醫(yī)學(xué)中的納米顆粒是一種人工制造的、大小不超過100 nm的微型顆粒。它的形態(tài)可能是乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒等。非生物原的納米顆粒一般包括共聚物水凝膠、納米凝膠、樹狀分子、碳富勒烯、固體脂質(zhì)納米顆粒、納米乳劑、可生物降解的聚丙交酯-乙交酯(PLGA)等;生物原的納米顆粒包括寡核苷酸、多糖以及可作為抗原、變應(yīng)原、病原體的相關(guān)分子模式等[1]。納米顆粒大小與細(xì)胞組分相近,能夠利用細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。其不僅具有免疫佐劑活性,有助于抗原在細(xì)胞內(nèi)加工,與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子特異性結(jié)合、運(yùn)輸并遞呈給效應(yīng)細(xì)胞,增強(qiáng)機(jī)體產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答,而且還能夠通過多種途徑到達(dá)抗原提呈細(xì)胞(APCs),調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在預(yù)防性和治療性疫苗中,納米顆粒被用作運(yùn)輸系統(tǒng)增加抗原提呈或作為免疫佐劑激活和增強(qiáng)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。近年來,隨著病毒樣顆粒(VLPs)的出現(xiàn),納米顆粒技術(shù)再次興起[2]。

      2 納米顆粒技術(shù)在豬病防治中的應(yīng)用

      2.1 納米PCR技術(shù)

      納米PCR技術(shù)是一種新型的PCR技術(shù),其原理為把粒徑為1~100 nm的固體納米金屬顆粒懸浮在液體里形成納米流體。由于納米流體相對(duì)于普通流體具有更強(qiáng)的熱導(dǎo)性,所以在添加了納米金屬顆粒的PCR熱循環(huán)體系中,PCR反應(yīng)會(huì)更快地達(dá)到目標(biāo)溫度,減少在非目標(biāo)溫度的停留時(shí)間,進(jìn)而縮短整個(gè)體系達(dá)到溫度平衡所用的時(shí)間,最終達(dá)到消除非特異性擴(kuò)增,提高特異性擴(kuò)增產(chǎn)量的目的。納米PCR檢測(cè)方法比常規(guī)PCR具有較高的靈敏性、特異性及可重復(fù)性,檢測(cè)結(jié)果可靠。

      偽狂犬病病毒(PRV)可引起母豬繁殖障礙及初生仔豬大批死亡;成年豬則出現(xiàn)隱性感染,長期帶毒排毒,嚴(yán)重影響種豬場(chǎng)生產(chǎn)及優(yōu)良品種的推廣,給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的損失。控制和消滅豬偽狂犬病所面臨的主要困難是確定偽狂犬病病毒的潛伏感染、野毒感染或疫苗感染。馬興杰等(2014)建立了鑒別PRV強(qiáng)弱毒高效納米PCR檢測(cè)方法,并對(duì)相關(guān)條件進(jìn)行優(yōu)化,組裝了試劑盒。對(duì)我國黑龍江、吉林等7個(gè)省市的117份樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示,PRV強(qiáng)毒陽性率為51%,陰性率為49%,未發(fā)現(xiàn)有弱毒感染。鑒別PRV強(qiáng)弱毒納米PCR試劑盒的研制,對(duì)PRV感染的早期檢測(cè)、野毒株和疫苗株的鑒別、疾病控制等都有重要意義。

      豬細(xì)小病毒(PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一,衣殼蛋白VP2 是PPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,決定著PPV的組織嗜性、毒力和血凝活性,并且能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。VP2在桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)中能夠自我組裝成VLPs,是亞單位疫苗研究的首選蛋白。崔宇超(2014)根據(jù)VP2蛋白成功構(gòu)建高效的PPV納米PCR檢測(cè)方法,并表明其比普通PCR更加敏感,比熒光定量PCR更加方便快捷。臨床上,在PPV感染初期或者后期病毒載量較低時(shí),應(yīng)用納米PCR檢測(cè)PPV能夠更加高效,重要的一點(diǎn)是該方法適合于基層實(shí)驗(yàn)室的使用。

      2.2 新型納米級(jí)吸附劑

      史瑩華等(2005)應(yīng)用納米技術(shù)構(gòu)建了專性高效吸附黃曲霉毒素的納米級(jí)硅酸鹽結(jié)構(gòu)微粒(NSP),通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)2個(gè)方面研究了NSP對(duì)黃曲霉毒素(AF)的吸附,并比較了NSP和普通硅酸鹽(SP)的吸附效果,結(jié)果表明在黃曲霉毒素污染的日糧(0.l mg/ kg的 AF)中,添加0.3%的NSP,可以極顯著地降低黃曲霉毒素在豬肌肉、肝、腎等組織中的殘留量;添加0.3% 的SP,有降低豬體組織中黃曲霉毒素殘留量的趨勢(shì),但效果不明顯。NSP之所以具有吸附黃曲霉毒素的顯著性能,主要?dú)w因于其能選擇性吸附和固定動(dòng)物胃腸道食糜中的黃曲霉毒素,形成穩(wěn)定的復(fù)合體,使之從糞便中排出體外。作為一種新型納米級(jí)吸附劑,NSP的應(yīng)用無疑為當(dāng)前生產(chǎn)中普遍存在的黃曲霉毒素污染問題找到了理想、可行的對(duì)策,為生產(chǎn)安全的動(dòng)物產(chǎn)品開辟了一條新途徑,為打破動(dòng)物產(chǎn)品國際貿(mào)易中黃曲霉毒素殘留限量的技術(shù)壁壘提供了科技支撐。

      2.3 新型納米飼料添加劑

      史瑩華等(2007)以生長肥育豬為試驗(yàn)對(duì)象,研究了其構(gòu)建的特異性高效吸附黃曲霉毒素B1的新型納米飼料添加劑—蒙脫石納米復(fù)合物(MN)緩解豬黃曲霉毒素中毒癥、降低豬體組織中黃曲霉毒素B1殘留量的效果。結(jié)果表明在黃曲霉毒素B1污染的日糧中添加0.3%的MN,顯著降低了黃曲霉毒素B1在豬體組織中的殘留量,明顯改善了試驗(yàn)豬的生長性能,減輕甚至消除了黃曲霉毒素B1對(duì)動(dòng)物生長性能和肝臟功能等的不良影響。這為納米級(jí)新型飼料添加劑的開發(fā)研制奠定了理論基礎(chǔ)。

      2.4 新型抗病毒材料

      銀納米顆粒是運(yùn)用納米技術(shù)將銀元素納米化后形成的尺寸在1~100 nm的銀原子團(tuán)族,有穩(wěn)定的化學(xué)和物理性能。近年來,銀納米顆粒由于具有優(yōu)良的抗微生物特性,已逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。呂曉楠(2014)以豬傳染性胃腸炎作為冠狀病毒模型,從細(xì)胞水平評(píng)價(jià)了3種不同的銀納米材料對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)感染宿主細(xì)胞及介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制效果。結(jié)果表明銀納米材料可有效地抑制TGEV感染細(xì)胞,其作用機(jī)制是通過滅活病毒亦或阻斷病毒侵入細(xì)胞。不同質(zhì)量濃度聚乙烯吡咯烷酮(PVP)表面修飾的銀納米材料具有的抗病毒效果各不相同,這為開發(fā)新型抗冠狀病毒藥物提供了新思路。

      2.5 免疫增強(qiáng)劑

      納米硒具有較強(qiáng)的低毒高效優(yōu)勢(shì)。在生物功效方面,納米硒體外清除羥自由基效率為無機(jī)硒的5倍,為有機(jī)硒的2.5倍。納米硒對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的保護(hù)研究已經(jīng)取得了較理想的結(jié)果。武梅等(2005)應(yīng)用PLGA納米顆粒包裹pUC18-CpG,研究了陽離子PLGA納米顆粒和脂質(zhì)體包裹后的pUC18-CpG對(duì)豬副傷寒疫苗接種小鼠免疫系統(tǒng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響,證明PLGA納米顆粒包裝能顯著提高裸CpG質(zhì)粒的免疫增強(qiáng)活性。陳建林等(2009)制備了包裹豬融合基因PIL-46和CpG基序的真核表達(dá)質(zhì)粒的殼聚糖納米顆粒,首次開展了豬IL-4和IL-6融合基因和CpG基序協(xié)同調(diào)節(jié)豬對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)疫苗免疫應(yīng)答的研究,結(jié)果表明 PIL-46基因和CpG基序經(jīng)殼聚糖納米顆粒分子包裝后接種實(shí)驗(yàn)豬,能夠顯著增強(qiáng)豬特異抗PRRS體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,有效提高接種動(dòng)物的抗病毒感染能力,促進(jìn)PRRS的免疫防治。李棟等(2011)研究認(rèn)為由殼聚糖納米顆粒(CNP)包裹重組分泌型VR1020質(zhì)粒(VPIL6C)是豬瘟特異性免疫應(yīng)答的新型有效免疫增強(qiáng)佐劑。所有這些納米級(jí)顆粒為研制高效安全和效應(yīng)持久的新型豬用分子免疫制劑增強(qiáng)劑奠定了基礎(chǔ),在加強(qiáng)豬抗傳染病的免疫保護(hù)中具有廣闊的應(yīng)用潛力。

      2.6 納米佐劑

      用納米顆粒做成的免疫佐劑叫納米佐劑。納米佐劑具有特殊的吸收、吸附、控釋和緩釋性能,具有常規(guī)佐劑不可比擬的優(yōu)勢(shì)。納米佐劑包括無機(jī)納米佐劑和有機(jī)納米佐劑。無機(jī)納米佐劑包括納米氫氧化鋁、磷酸鈣等;有機(jī)納米佐劑包括殼聚糖及其衍生物、PLGA、蜂膠等。

      PRRS在世界范圍內(nèi)的豬場(chǎng)廣泛流行, PRRSV的快速遺傳突變使現(xiàn)有疫苗無法抵抗新出現(xiàn)病毒株。Li等(2013)評(píng)價(jià)了多肽納米纖維水凝膠(H9e)作為PRRSV改性活病毒(MLV)疫苗佐劑的效果。用茵格發(fā)PRRSV-MLV疫苗或用H9e免疫佐劑處理的茵格發(fā)PRRSV-MLV疫苗免疫豬,然后接種PRRSV父母疫苗株或遺傳變異株。結(jié)果表明,H9e與PRRSV-MLV疫苗聯(lián)合使用,能通過改變體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)來增強(qiáng)抵抗兩種PRRSV病毒株的疫苗效力。

      口蹄疫病毒(FMDV)感染偶蹄動(dòng)物和人引起人畜共患病。楊帆帆(2010)通過機(jī)械球磨法將常規(guī)粒徑的藥用活性炭加工成納米活性炭,通過觀察納米活性炭作為豬口蹄疫O型多肽疫苗的佐劑效果,結(jié)果表明納米活性炭在體外雖存在緩釋作用,但是其作為佐劑并沒有達(dá)到預(yù)期的緩釋和免疫增強(qiáng)效果。王剛(2010)以牛IL-6基因作為黏膜分子佐劑,吸附殼聚糖PLGA納米微球載口蹄疫DNA疫苗通過鼻免疫豚鼠,結(jié)果表明能夠促進(jìn)口蹄疫DNA疫苗黏膜免疫。王永林等[3](2010)采用新型納米佐劑按照不同比例配制口蹄疫O型、AsiaⅠ型雙價(jià)滅活疫苗,對(duì)疫苗的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明新型佐劑疫苗黏度低、易注射、穩(wěn)定性好、安全、免疫副反應(yīng)小、免疫效果好。唐冬梅等(2015)成功構(gòu)建了以多層磷酸鈣納米顆粒為載體的O型FMDV VP1和VP2基因重組質(zhì)粒,為O型口蹄疫新型重組基因疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

      豬鏈球菌病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展造成極大危害,其中豬鏈球菌2型(SS2)為人畜共患傳染病,嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。韓芳(2013)以三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑,采用離子交聯(lián)法制備載IgY殼聚糖納米微粒,采用響應(yīng)面法優(yōu)化載IgY殼聚糖納米微粒的制備工藝,體外釋放性能研究結(jié)果表明,載IgY殼聚糖納米微粒具有良好的緩釋性能,其在預(yù)防和治療豬鏈球菌病方面,將具有廣闊的應(yīng)用前景。殼聚糖是一種陽離子多聚糖,來源于甲殼類動(dòng)物外殼中的甲殼質(zhì),是自然界中惟一含游離氨基堿性基的可食性動(dòng)物纖維,它具有良好的生物相溶性和低毒性及促滲作用,可通過多種方法與抗原分子結(jié)合,形成納米顆粒。殼聚糖納米顆粒理化特性穩(wěn)定,且免疫途徑多樣,具有較好的應(yīng)用前景。

      豬支原體肺炎(MPS),又稱豬喘氣病,是一種呼吸道飛沫性傳染病。趙卓等[4](2009)借助6035納米佐劑,以改變豬支原體肺炎凍干疫苗的免疫途徑,將胸腔注射改為肌肉注射,不僅確保疫苗發(fā)揮原有的免疫功效,而且很大程度上可增強(qiáng)疫苗的免疫效果,肺炎減少率均達(dá)到80%以上。6035納米佐劑是采用特殊工藝技術(shù)制備的一種新型納米顆粒佐劑,佐劑中含有免疫增強(qiáng)劑和免疫緩釋劑,既可增強(qiáng)藥物靶向性,增強(qiáng)疫苗免疫活性,又以延長疫苗的免疫期。

      李萍等(2012)研制了一種基于天然多糖納米凝膠(AP-SS)的新型疫苗佐劑。這種納米凝膠的主要成分是海藻酸鈉,一種存在于褐藻細(xì)胞壁中的天然多糖。AP-SS可作為一種安全高效的疫苗載體和佐劑,全面提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫。李樹鵬(2012)以納米乳給藥系統(tǒng)為載體,對(duì)中藥黃芪多糖進(jìn)行劑型改造,研制出黃芪多糖納米乳(APS-NE)給藥系統(tǒng)。納米乳是目前研究較多的一種疫苗佐劑。它是一個(gè)由油、水、表面活性劑、助表面活性劑4個(gè)組分組成的、粒徑在10~100 nm范圍、液滴多為球形,大小均勻,透明或半透明、具熱力學(xué)穩(wěn)定和各向同性、熱壓滅菌和高速離心穩(wěn)定,不分層的膠體分散系統(tǒng)。納米乳作為一種新型藥物載體,具有眾多其他藥物載體無可比擬的優(yōu)點(diǎn),使其在藥劑學(xué)領(lǐng)域中顯示出誘人的發(fā)展前景,應(yīng)用日益廣泛。

      趙卓等(2008)分別采用新型納米佐劑和傳統(tǒng)白油佐劑配制豬偽狂犬病滅活疫苗,對(duì)兩組疫苗進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定,結(jié)果表明新型納米佐劑疫苗具有穩(wěn)定性高,黏度低,吸收良好,免疫副反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn),免疫增強(qiáng)效果明顯優(yōu)于白油佐劑。郭沛等[5](2012)研究了納米磷酸鈣(NCaP)作為豬瘟多肽疫苗佐劑的可行性,其利用豬瘟多肽疫苗作為抗原,制備納米磷酸鈣吸附豬瘟多肽疫苗。結(jié)果表明,NCaP作為佐劑相對(duì)游離豬瘟多肽可提高其免疫效果。徐衛(wèi)松等(2014)研究表明以納米二氧化硅為佐劑制備的豬傳染性胃腸炎(TGE)滅活疫苗能顯著提高機(jī)體的免疫水平,并能刺激機(jī)體更快地產(chǎn)生有效抗體,且抗體水平持續(xù)時(shí)間較長,并能在一定程度上增強(qiáng)豬傳染性胃腸炎滅活疫苗的細(xì)胞免疫強(qiáng)度,具有較好的免疫保護(hù)效果??軄嗛萚6](2015)研究認(rèn)為以納米鋁膠為佐劑制備的豬細(xì)小病毒滅活疫苗,能顯著提高機(jī)體的免疫水平,并較早刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,具有較好的免疫保護(hù)效果。

      2.7 納米顆粒疫苗

      近年來,通過化學(xué)或基因方法修飾過的病毒納米顆粒作為潛在的優(yōu)秀載體運(yùn)輸工具和免疫增強(qiáng)劑已被廣泛應(yīng)用到多個(gè)方面[7]。采用納米技術(shù)所制成的攜帶各種疫苗并能精確釋放的微芯片或是包裹、表面結(jié)合疫苗的納米粒子只要一次性植入畜禽體內(nèi),就可終身對(duì)各種傳染病產(chǎn)生免疫。不但可以避免現(xiàn)行因多次免疫接種給機(jī)體造成的應(yīng)激而給生產(chǎn)帶來損失,而且大大提高了免疫效果,徹底改變了現(xiàn)行免疫方法的程序。納米顆粒疫苗不僅能夠提高抗原的穩(wěn)定性、增強(qiáng)抗原的遞呈和免疫原性,同時(shí)也能夠靶向性遞呈抗原和緩慢釋放。張建遠(yuǎn)(2009)成功構(gòu)建了豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)核酸疫苗,并使用殼聚糖對(duì)核酸疫苗進(jìn)行了包被,為研制新型、高效、安全的PCV2核酸疫苗及測(cè)定評(píng)價(jià)豬細(xì)胞因子分子免疫佐劑提供了理論依據(jù)。歐陽康(2013)首次將荊豆凝集素(UEA)與二乙烯亞胺(BEI)滅活的PRRSV病毒抗原包埋到PLGA納米顆粒中制成疫苗,結(jié)果顯示同時(shí)包埋UEA與抗原的PLGA納米顆粒疫苗比單獨(dú)只包埋抗原的效果好。

      3 前景與展望

      納米顆粒技術(shù)是一門具有廣闊前景的新興技術(shù),納米技術(shù)與免疫技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物—納米佐劑已成為了當(dāng)前疫苗研究的熱點(diǎn)。利用不同形式的納米佐劑可以通過多種途徑提高腫瘤疫苗的免疫效應(yīng)和治療效果。納米佐劑作為疫苗遞送系統(tǒng)能夠模擬病原體的一些關(guān)鍵特征,如大小、形狀、表面性質(zhì)等,從而激發(fā)機(jī)體的免疫功能。目前對(duì)納米佐劑的研究已經(jīng)取得了一定的成果,但大多數(shù)還處于試驗(yàn)階段,還存在許多問題沒有解決,如很難合成具有物理性質(zhì)一致的納米顆粒,缺乏對(duì)納米顆粒的物理性質(zhì)是如何影響其生物分布和定位的基本認(rèn)識(shí),以及這些特性如何影響它們與生物系統(tǒng)之間的相互作用等,離臨床應(yīng)用還有一定的差距[8]。但是,隨著納米生物技術(shù)的發(fā)展和研究的深入,借助生物納米材料為疫苗載體和佐劑系統(tǒng)的研制提供的契機(jī)和思路,相信開發(fā)更加高效、安全、穩(wěn)定的獸用新型疫苗和疫苗佐劑將指日可待。

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      收稿日期:(2015-07-22)

      作者簡(jiǎn)介:莊金秋(1978-),女,山東濰坊人,獸醫(yī)碩士,副研究員,主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物用病毒疫苗研制。

      基金項(xiàng)目:山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GSF121027);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-022-15)

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