郜　娜，　楊慶宇,　劉秀梅

(1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，2鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部， 河南 鄭州 450000)

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丁苯酞對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化及主動脈壁VCAM-1表達(dá)的影響

郜娜1△，楊慶宇2,劉秀梅2

(1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，2鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部， 河南 鄭州 450000)

[摘要]目的： 觀察丁苯酞對ApoE-/-小鼠主動脈粥樣斑塊形成及血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1表達(dá)影響，以探討其抗動脈粥樣硬化的可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)意義。方法: 90只6周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為3組，高脂飼喂建立動脈粥樣硬化模型，同時灌胃給予丁苯酞100及200 mg·kg-1·d-1進(jìn)行干預(yù)，模型組給予等量生理鹽水灌胃。30只同齡雄性野生型C57BL/6J小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)作為正常對照組。各組在18周齡及30周齡時分別處死15只動物。實驗過程中記錄各組小鼠體重變化及進(jìn)食進(jìn)水量。采用全自動生化儀檢測18周齡及30周齡各組小鼠血脂水平；ELISA法檢測血清ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量；取主動脈根部石蠟包埋切片行HE染色進(jìn)行病理學(xué)檢查，計算斑塊相對面積；取胸主動脈進(jìn)行real-time PCR檢測VCAM-1的mRNA含量，同時用Western blot法檢測VCAM-1的蛋白水平。結(jié)果: 與對照組相比，模型組小鼠18周齡及30周齡時體重、血脂及炎癥因子均顯著升高，且均發(fā)生動脈粥樣硬化斑塊，且VCAM-1的mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加；丁苯酞對模型小鼠體重及進(jìn)食進(jìn)水量無影響；但丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1劑量組血脂水平顯著降低；血清ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量亦顯著減少；主動脈根部粥樣斑塊面積顯著減??；胸主動脈VCAM-1 的mRNA水平及蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。結(jié)論: 丁苯酞可延緩高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生，其機(jī)制與其同時降低血脂及抑制炎癥的發(fā)生，進(jìn)而降低主動脈VCAM-1有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]丁苯酞；ApoE-/-小鼠； 動脈粥樣硬化； 血管細(xì)胞黏附分子-1

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重威脅人類健康的慢性炎性疾病之一，諸多細(xì)胞及分子通路介導(dǎo)血管炎癥因子的產(chǎn)生[1]。經(jīng)研究顯示，在AS發(fā)生機(jī)制中血管內(nèi)皮細(xì)胞過度表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhension molecular-1，VCAM-1)是其主要危險因素[2-3]。在相關(guān)臨床報道中，發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死以及腦中風(fēng)病人血清中游離VCAM-1明顯高于對照組，并隨著病情的緩解而逐漸下降。因此，VCAM-1作為內(nèi)皮功能障礙的標(biāo)志，與C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)及TNF-α等炎癥因子也具有緊密聯(lián)系，可共同預(yù)測心血管事件的發(fā)生[4-6]。藥物干預(yù)降低血管內(nèi)皮細(xì)胞過度表達(dá)成為近幾年預(yù)防及治療心腦血管疾病熱點。丁苯酞(butylphthalide，BP)最初是由芹菜籽中提取，后經(jīng)實驗室合成，并于2002年被CFDA批準(zhǔn)用于臨床中風(fēng)患者的治療，其可通過減少氧化應(yīng)激、改善線粒體功能、抑制血栓素A2的合成及阻止炎癥的發(fā)生等機(jī)制，達(dá)到解除微血管痙攣、抑制血小板聚集、保護(hù)腦細(xì)胞等作用[7]。此外，動物實驗證明丁苯酞可減少動物腦細(xì)胞淀粉樣變，繼而減少阿爾茲海默癥的發(fā)生。但丁苯酞對于動脈粥樣硬化病理發(fā)展以及內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1表達(dá)的影響報道甚少。本實驗通過高脂飲食誘導(dǎo)載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-knockout，ApoE-/-)小鼠建立AS模型，給予丁苯酞進(jìn)行干預(yù)，觀察主動脈中VCAM-1的mRNA及蛋白表達(dá)變化，探討丁苯酞抗AS的作用機(jī)制。

材料和方法

1實驗動物、試劑和儀器

90只6周齡雄性ApoE-/-小鼠(品系C57BL/6J)，30只同齡雄性C57BL/6J野生型小鼠，均購自北京大學(xué)實驗動物中心，合格證編號為SCXK(京)2011-0012。丁苯酞軟膠囊由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司饋贈；氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)、CRP、TNF-α及IL-6 ELISA試劑盒均購自R&D；VCAM-1抗體及 II 抗均購自CST；SP試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光試劑盒均購自TaKaRa；低溫離心機(jī)(Thermo)；切片機(jī)(Leica)；光學(xué)顯微鏡(Olympus)；蛋白電泳及顯影系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2實驗方法

2.1動物分組、模型復(fù)制及給藥90只雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組及丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1組，每組30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予高脂飼料[含1.25%膽固醇、22.62%蛋白質(zhì)、44.13%碳水化合物及20.06%油脂(豆油2.79%，可可脂17.27%)]復(fù)制動脈粥樣硬化模型，造模開始同時灌胃給予丁苯酞100 mg·kg-1·d-1及200 mg·kg-1·d-1進(jìn)行干預(yù)。30只C57BL/6J作為正常對照組，給予維持飼料飲食。各組小鼠飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境中，自由飲食飲水，維持12 h/12 h明暗交替，溫度(25±1) ℃，濕度55%～65%。實驗過程中，每周監(jiān)測動物體重及進(jìn)食進(jìn)水量。在高脂飼喂(即給藥干預(yù))12周及24周分別處死各組15只小鼠。實驗結(jié)束前禁食不禁水12 h，摘取眼球取血，4 ℃靜置30 min后，1 500 r/min離心15 min，取血清，-20 ℃保存待用。分離主動脈弓固定于4%甲醛，胸主動脈置于-80 ℃冰箱中保存待用。

2.2血清學(xué)指標(biāo)的測定全自動生化儀檢測血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(trigly-ceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量。

2.3病理學(xué)檢查固定完全的主動脈根部進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚為4 μm。切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，酸水及氨水中分色，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。Image-Pro Plus 6.0 形態(tài)計量學(xué)測算斑塊面積及血管內(nèi)外膜長度，回歸標(biāo)準(zhǔn)圓形后計算斑塊面積與血管管腔面積相對比值。

2.4RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用TRIzol兩步法抽提主動脈的總RNA，按照TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求反轉(zhuǎn)錄提取總RNA，10 μL 反應(yīng)體系如下: RNA 1 μg，5× PrimeScript buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Prime (50 μmol/L) 0.5 μL，Random 6-mers (100 μmol/L) 0.5 μL，去RNA酶水4.5 μL。 反應(yīng)條件為42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，最后得到的cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5Real-time PCR檢測主動脈血管中VCAM-1的mRNA 表達(dá)采用實時熒光定量PCR 檢測VCAM-1的mRNA 表達(dá)，內(nèi)參照為GAPDH，由大連寶生物設(shè)計引物序列。VCAM-1的上游引物為5’-ATTTTCTGGGGCAGGAAGTT-3’，下游引物為5’-ACGTCAGAACAACCGAATCC-3’；GAPDH 的上游引物為5’-AACTGCTTAGCACCCCTGGC-3’，下游引物為5’-ATGACCTTGCCCACACAGCCTT-3’。PCR反應(yīng)體系為SYBR Prime Ex Taq (Tli RNaseH Plus) 10 μL，PCR上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，PCR下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，DNA 模板2 μL，dH2O 6.8 μL，按2-ΔΔCt法計算mRNA含量。

2.6Western blot法檢測主動脈血管中VCAM-1的蛋白表達(dá)胸主動脈約25 mg在0.5 mL蛋白裂解液中勻漿3次，每次間隔30 s，勻漿液4 ℃ 3 000×g離心15 min，收集上清，4 ℃ 12 000×g離心15 min，再次收集上清為總蛋白。蛋白濃度通過Bradford法檢測，計算各樣本中蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)上樣緩沖液處理后，先進(jìn)行5%～15% SDS-PAGE，160 V電泳后，4 ℃、100 V電泳轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)移膜經(jīng)5%、以TBST稀釋的脫脂奶粉室溫封閉2 h； I 抗(以TBST 1∶1 000稀釋)4 ℃過夜，用TBST振蕩沖洗3遍；II 抗(以TBST 1∶2 000稀釋)室溫作用2 h，用TBST振蕩沖洗3遍。轉(zhuǎn)移膜最后用ECL試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，Quantity One軟件分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件處理。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1丁苯酞對模型小鼠體重及進(jìn)食量的影響

各組小鼠體重變化及進(jìn)食量情況如表1所示，與對照組相比，模型組小鼠在18周齡和30周齡時，體重均顯著高于平行對照組。灌胃給予丁苯酞100及200 mg·kg-1·d-1干預(yù)，小鼠體重與模型組相比無顯著差異。各組小鼠進(jìn)食量在實驗過程中無明顯差異。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2丁苯酞對模型小鼠血脂水平的影響

各組小鼠血脂水平如表2所示，與對照組相比，模型組小鼠血清在18周齡和30周齡時TC、TG及LDL-C均顯著升高，HDL-C水平顯著下降，且30周齡后小鼠血脂變化較18周齡更顯著。造模之初即給予丁苯酞進(jìn)行干預(yù)至18周齡和30周齡，可見100及200 mg·kg-1·d-1劑量組小鼠血清中TC、TG及LDL-C水平較模型組顯著降低，HDL-C含量顯著升高。且丁苯酞對模型小鼠血脂干預(yù)作用呈現(xiàn)一定劑量依賴性。

3丁苯酞對小鼠血清炎癥因子水平的影響

與對照組相比，模型組小鼠在18周齡和30周齡時血清中ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量均顯著增加，灌胃給予丁苯酞治療至18周齡和30周齡可劑量依賴性地降低模型小鼠血清升高的ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量，見表3。

4丁苯酞對模型小鼠主動脈粥樣硬化斑塊病理發(fā)展的影響

如圖1所示，對照組小鼠即野生型C57BL/6J小鼠在平行飼養(yǎng)至18周齡和30周齡時均可見主動脈壁薄厚均勻，內(nèi)膜完整，內(nèi)壁光滑無動脈粥樣硬化斑塊形成；模型組ApoE-/-小鼠高脂飼喂至18周齡的情況下可見主動脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)壁不光滑，局部可見明顯動脈粥樣硬化斑塊，呈現(xiàn)向管腔發(fā)展的占位性病變，高脂飼喂至30周齡，主動脈根部動脈粥樣硬化情況更嚴(yán)重；造模的同時給予丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1進(jìn)行干預(yù)，至18周齡和30周齡時與平行模型組相比，均可見斑塊面積及病變程度均顯著減輕，且具有劑量依賴性。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.05,##P<0.01vsmodel.

Figure 1. Observation of aortas in each group (HE staining, ×200).

圖1各組小鼠主動脈圖

各組小鼠主動脈粥樣硬化斑塊定量分析結(jié)果可見，模型組顯著高于對照組，丁苯酞低、高劑量組與模型組相比，粥樣硬化斑塊面積/動脈總面積顯著降低，見圖2。

5丁苯酞對模型小鼠主動脈VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響

在18周齡和30周齡時，模型組小鼠主動脈VCAM-1的mRNA表達(dá)顯著高于平行對照組小鼠，灌胃給予丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1在18周齡和30周齡時后均可顯著降低模型小鼠主動脈中上調(diào)的VCAM-1的mRNA表達(dá)，并呈一定劑量依賴性。

Figure 2. Comparison of plaque area/lumen area in each group. Mean±SEM.n=15.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

圖2各組小鼠斑塊面積與管腔面積比值的比較

Figure 3. The mRNA level of VCAM-1 in the aortas of each group. Mean±SEM.n=15.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

圖 3各組小鼠主動脈中VCAM-1 mRNA水平

6丁苯酞對模型小鼠主動脈VCAM-1蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組小鼠主動脈VCAM-1蛋白表達(dá)均顯著升高；丁苯酞可劑量依賴性地降低模型小鼠主動脈中VCAM-1蛋白的表達(dá)，見圖4。

Figure 4. The protein level of VCAM-1 in the aortas of each group. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

圖 4各組小鼠主動脈中VCAM-1蛋白水平

討論

AS是一種累及全身大、中動脈內(nèi)膜的慢性炎癥性疾病，脂質(zhì)代謝異常和炎癥反應(yīng)是AS發(fā)生和發(fā)展的主要危險因素，目前學(xué)術(shù)界認(rèn)可度較高的AS發(fā)病機(jī)制是Virchow的動脈粥樣硬化脂質(zhì)浸潤學(xué)說[8]和經(jīng)Ross完善的炎癥學(xué)說[1]。在高血脂等致炎因子的作用下，VCAM-1及ICAM-1等在介導(dǎo)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附及其相互作用方面起到了關(guān)鍵作用，活化的黏附分子與單核細(xì)胞表面受體結(jié)合，促使單核細(xì)胞黏附到損傷的內(nèi)皮上，因此這些黏附分子的激活與否影響著AS病變的形成與發(fā)展。VCAM-1是一種介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間黏附及相互作用的膜表面糖蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及平滑肌細(xì)胞表面表達(dá)。研究表明應(yīng)用藥理途徑降低動脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)或功能可阻抑或減慢AS發(fā)生[9]。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，可表達(dá)于白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞，尤其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)最強(qiáng)。VCAM-1和ICAM-1在抗原表達(dá)過程中可以作為淋巴細(xì)胞的共刺激信號，在AS中進(jìn)一步發(fā)揮作用。

對于VCAM-1及ICAM-1的激活的具體機(jī)制，有研究表明，高膽固醇血癥發(fā)生時，體內(nèi)抗氧化因子活性降低，氧自由基生成增多，LDL經(jīng)氧自由基修飾形成ox-LDL，其可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB及TNF-α，誘導(dǎo)或上調(diào)VCAM-1。另有研究證實，CRP可刺激單核細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)IL-6和TNF-α誘發(fā)血管炎癥，且通過加重血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，上調(diào)VCAM-1的表達(dá)，激活補體系統(tǒng)，促進(jìn)血栓形成，參與AS的形成及發(fā)展。

本實驗研究中選用的ApoE-/-小鼠，是目前公認(rèn)的進(jìn)行藥物抗動脈粥樣硬化活性篩選及作用機(jī)制的最經(jīng)典的動物模型之一[10]，而C57BL/6J小鼠與其具有相同的遺傳背景，在研究中常作為正常對照組。ApoE-/-小鼠在正常飲食及高脂飲食情況下血脂均會升高，且其發(fā)病機(jī)制與人類動脈粥樣硬化形成過程相似。已有研究報告，ApoE-/-小鼠在5～6周齡時主要是單核細(xì)胞趨附于損傷的內(nèi)皮細(xì)胞處，8～10周齡出現(xiàn)脂紋，15～20周齡后逐漸出現(xiàn)纖維斑塊，病變部位以主動脈根最為明顯，其次為胸主動脈[11]。本實驗中持續(xù)給予ApoE-/-小鼠高脂飼喂12周即18周齡，可見模型組小鼠血脂水平顯著升高，并且主動脈發(fā)生動脈粥樣硬化斑塊沉積。且血清中炎癥因子CRP、TNF-α及IL-6高表達(dá)。根據(jù)以上論述內(nèi)容，高血脂及升高的炎癥因子水平會誘導(dǎo)黏附因子VCAM-1的高表達(dá)，本實驗結(jié)果從蛋白及mRNA水平均證實了這一點，但值得注意的是30周齡時模型組血脂和炎癥因子水平高于18周齡小鼠，動脈粥樣硬化情況亦較為嚴(yán)重，但30周齡模型組小鼠胸主動脈中VCAM-1 mRNA及蛋白水平確低于18周齡小鼠，可以看出VCAM-1是動脈粥樣硬化發(fā)生早期一個重要的致病因素。造模初期即給予丁苯酞持續(xù)干預(yù)12周及24周后，可見血脂及炎癥因子均劑量依賴性地降低，VCAM-1的蛋白和mRNA水平均顯著下降，可見丁苯酞是同時通過降低血脂及減少炎癥因子，進(jìn)而降低VCAM-1在主動脈中的表達(dá)，抑制或延緩AS的發(fā)生。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects of butylphthalide on atherosclerosis lesion and VCAM-1 expression in aortic wall of ApoE-/-mice

GAO Na1, YANG Qing-yu2, LIU Xiu-mei2

(1DepartmentofPharmacy,AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,HenanCancerHospital,2DepartmentofPharmacy,People’sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450000,China.E-mail:gn_submit@163.com)

[KEY WORDS]Butylphthalide;ApoE-/-mice; Atherosclerosis; Vascular cell adhesion molecular-1

[ABSTRACT]AIM: To observe the protective effects of butylphthalide on atherosclerosis lesion and vascular cell adhesion molecular-1 (VCAM-1) expression in the aortic wall ofApoE-/-mice, and to explore the possible mechanism underlying these beneficial effects.METHODS: MaleApoE-/-mice at 6 weeks of age (n=90) were randomly divided into 3 groups. ThirtyApoE-/-mice fed with high-fat diet and treated with saline simultaneously were defined as model group. ThirtyApoE-/-mice fed with high-fat diet and treated with butylphthalide (100 and 200 mg·kg-1·d-1) were defined as treatment groups. Thirty wild-type C57BL/6J mice treated with saline were defined as control group. Fifteen mice in each group were sacrificed both at the ages of 18 and 30 weeks. The body weight, food intake and water intake were monitored weekly through the experiment. The lipid profiles were determined both at 18 and 30 weeks of age. Aortic roots were stained with hematoxylin and eosin for pathological examination. Serum ox-LDL, CRP, TNF-α and IL-6 were examined by ELISA. The expression of VCAM-1 at mRNA and protein levels was determinate by real-time PCR and Western blot in the thoracic aortas. RESULTS: Compared with control group, at 18 and 30 weeks of age, the body weight, serum lipid profiles and inflammatory factors were increased, while the atherosclerotic plaques were raised. The mRNA and protein levels of VCAM-1 were up-regulated. However, serum lipid levels in butylphthalide treatment groups (both at doses of 100 and 200 mg·kg-1·d-1) were decreased significantly. Serum ox-LDL, CRP, TNF-α and IL-6 were also decreased by butylphthalide treatment. Furthermore, atherosclerotic plaque areas in the aortic roots were reduced by butylphthalide treatment. In addition, the expression of VCAM-1 at mRNA and protein levels in the thoracic aortas was down-regulated by butylphthalide treatment.CONCLUSION: Butylphthalide delays the occurrence of high-fat diet-induced atherosclerosis and down-regulates the expression of VCAM-1 in theApoE-/-mice, which may be due to its alleviative effects on hyperlipidemia and inflammation.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1037- 06

[收稿日期]2015- 06- 12[修回日期] 2016- 03- 22

通訊作者△Tel: 0371-65588134; E-mail: gn_submit@163.com

[中圖分類號]R541.4; R972+.6

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.013