肢體缺血預(yù)處理的研究進展

王　芳　袁　強　孫曉彩

(河北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，河北　石家莊　050017)

肢體缺血預(yù)處理的研究進展

王芳袁強孫曉彩

(河北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，河北石家莊050017)

〔關(guān)鍵詞〕肢體缺血預(yù)處理；缺血再灌注損傷；腦缺血耐受

缺血性腦病嚴重威脅著人類的生命健康，具有高發(fā)病率、高死亡率及高致殘率等特點。傳統(tǒng)的方法有改善血流狀態(tài)、藥物治療、手術(shù)介入及中醫(yī)中藥等。然而，即使缺血后恢復(fù)了血液供應(yīng)，受損的神經(jīng)元也難以再生，給患者帶來了嚴重的后遺癥。如何提高神經(jīng)元對缺血性損害的抵抗能力，使其在蒙受較嚴重的缺血時減輕損傷、保持存活，以保證恢復(fù)血液供應(yīng)后這些神經(jīng)元仍具有正常的功能，是醫(yī)務(wù)人員面臨的嚴峻問題。

1肢體缺血預(yù)處理(LIP)的提出

1990年，日本科學(xué)家Kitagawa等〔1〕首先發(fā)現(xiàn)了腦缺血耐受現(xiàn)象，即預(yù)先給予輕微、短時、不至于引起神經(jīng)元損傷的腦缺血，可以保護神經(jīng)元，使其能夠耐受其后的通常會引起神經(jīng)元損傷的較嚴重的腦缺血；預(yù)先給予的輕微、短時的腦缺血稱為LIP。這表明LIP可以減輕腦缺血所造成的缺血再灌注損傷。盡管LIP誘導(dǎo)腦缺血耐受是一種強大的內(nèi)源性保護，然而對中樞器官進行缺血預(yù)處理，很難作為一種預(yù)防措施直接應(yīng)用于臨床。Zhao等〔2〕研究證實，反復(fù)3次股動脈夾閉和再灌注的LIP可減輕隨后即刻發(fā)生的腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮了腦保護作用。這種對非重要生命器官的缺血預(yù)處理具有較好的可操作性和易接受性，臨床應(yīng)用前景良好。

2LIP在一些器官的保護作用

2.1心臟Lim等〔3〕在冠狀動脈缺血再灌注模型中證實，提前阻斷小鼠左側(cè)股動脈5 min、再灌注5 min，反復(fù)3次后，心肌梗死面積較未做處理組明顯減少，提示LIP對隨后的心臟缺血性損傷具有保護作用，另外遠程缺血預(yù)處理的抗心肌缺血作用在包括人類在內(nèi)的不同物種中得到了證實。在臨床實驗觀察中，Manchurov等〔4〕第一次證明了在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)前進行遠端缺血預(yù)處理后能明顯改變急性心肌梗死患者的血管內(nèi)皮細胞的功能，并且這種保護作用至少持續(xù)1 w。在進一步關(guān)于LIP心臟保護機制的實驗中，研究者發(fā)現(xiàn)，體液循環(huán)介質(zhì)發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并確定了載脂蛋白C、結(jié)合珠蛋白α、甲狀腺素運載蛋白單體形式、甲狀腺素運載蛋白二聚體形式、血紅蛋白β、載脂蛋白A-IV和纖維蛋白原β等七種調(diào)節(jié)蛋白的保護作用〔5〕。

2.2腦在LIP腦保護作用的研究中，文雅惠等〔6〕通過觀察動物的神經(jīng)功能及組織學(xué)損害后證實，LIP可明顯減輕腦缺血引起的神經(jīng)功能缺損及組織學(xué)損害，從而誘導(dǎo)腦缺血耐受，在此過程中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板源生長因子-B(PDGF-B)的表達明顯增加，提示LIP可通過上調(diào)VEGF和PDGF-B的表達發(fā)揮腦保護作用，血管新生包括內(nèi)皮細胞增殖和血管壁形成，VEGF是與血管新生關(guān)系最為密切的生長因子，PDGF-B在血管壁形成過程中有重要作用，因此血管形成可能在腦保護中也發(fā)揮了重要作用。另有研究指出〔7〕，LIP的這種腦保護作用可能是通過下調(diào)IL-7實現(xiàn)抗感染作用、抑制海馬錐體細胞的凋亡以及激活腺苷AL受體而實現(xiàn)。

2.3肺臨床上一些疾病，如器官移植、外傷及外科手術(shù)等均可引起器官缺血，當恢復(fù)血流供應(yīng)后可能會造成缺血再灌注損傷，而肺臟是最易受損的器官之一。資料顯示，大鼠肢體缺血再灌注后肺組織MPO活性增加、W/D及CD18陽性細胞數(shù)目增多、細胞間黏附分子(ICAM)-1表達上調(diào)，而實驗中給予LIP可以通過抑制上述變化，實現(xiàn)對肺臟的保護作用〔8〕。

2.4肝臟有關(guān)研究指出〔9〕，LIP可以對抗大鼠肝臟的缺血再灌注損傷，可能與其抑制肝臟的炎性反應(yīng)以及改善肝臟的微循環(huán)有關(guān)。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在預(yù)處理的后期，LIP可以通過抑制細胞絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和C-Jun氨基端激酶(JNK)的磷酸化而減輕家兔肝臟的缺血再灌注損傷〔10，11〕。

3LIP腦保護作用的研究

近年來，我室致力于大鼠四血管閉塞全腦缺血耐受模型的研究，發(fā)現(xiàn)反復(fù)3次股動脈夾閉和開放的LIP可減輕隨后即刻發(fā)生的腦缺血再灌注損傷，降低海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡和凋亡，從而發(fā)揮腦保護作用，其機制尚未完全明確，涉及多信號通路。

3.1內(nèi)源性NO參與LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受NO是以L-精氨酸為前體物質(zhì)，在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下合成的一種氣體型信號分子。研究發(fā)現(xiàn)，LIP后大鼠海馬CA1區(qū)及血漿中NO及NOS活性增高，而在LIP前腹腔注射NOS的抑制劑L-NAME可明顯阻斷LIP的神經(jīng)保護作用〔2〕。提示NO可能與LIP誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞的缺血耐受性有關(guān)。

3.2絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通道參與LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受

3.2.1p38 MAPK通路p38 MAPK信號傳導(dǎo)通路是MAPK家族中的分支之一，它通過磷酸化改變基因的表達水平，參與細胞內(nèi)的信息傳遞，能對多數(shù)的細胞外刺激作出反應(yīng)，介導(dǎo)細胞的生長、發(fā)育、分化及死亡的全過程。Sun等〔11〕研究證實，LIP上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回區(qū)p-p38 MAPK的表達，提示LIP可能通過上調(diào)p38 MAPK的表達發(fā)揮腦保護作用。為進一步確定p38 MAPK在LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受的作用，LIP前側(cè)腦室注射p38 MAPK特異性抑制劑SB 203580抑制p38 MAPK的功能，或是LIP前側(cè)腦室注射p38 MAPK反義寡聚脫氧核苷酸(As-ODN)抑制p38 MAPK的表達，研究進一步證實了p38 MAPK表達上調(diào)參與了LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受〔12〕。

在進一步的研究中，探討了LIP腦保護作用中p38 MAPK可能的下游機制：(1)超氧化物歧化酶(SOD)。LIP顯著抑制了腦缺血引起的海馬CA1區(qū)SOD活性下降、MDA含量的增加，而預(yù)先給予SB 203580可明顯阻斷LIP的上述保護作用，提示SOD作為p38 MAPK的下游分子在腦缺血耐受的誘導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用〔13〕。(2)HSP 70。HSP 70是一種內(nèi)源性保護蛋白，通常認為HSP 70可提高細胞對各種損傷因子的耐受性，在保護細胞結(jié)構(gòu)和功能上起到重要作用〔14〕。

3.2.2細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路2006年，Jin等〔15〕應(yīng)用Western印跡和流式細胞技術(shù)觀察了LIP后及在LIP前給予ERK特異性抑制劑PD 98059后p-ERK1/2的表達情況。結(jié)果顯示，LIP后大鼠海馬各區(qū)p-ERK1/2的表達均明顯增多，只是時間不同步，在海馬CA1區(qū)p-ERK1/2于LIP后6 h 表達開始增加，12 h 達到峰值，隨后表達量逐漸下降，5 d 時回降至對照組水平；而在CA3區(qū)和DG區(qū)p-ERK1/2的表達在LIP后1 d 開始增加、3 d達到峰值，隨后表達量下降，但是至5 d 時表達量仍高于對照組水平。LIP前右側(cè)腦室注射ERK特異性抑制劑PD 98059明顯阻斷了LIP的神經(jīng)保護作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。上述研究結(jié)果表明，LIP通過上調(diào)海馬ERK的表達對抗腦缺血后神經(jīng)元的延遲性死亡。

3.3腦紅蛋白(Ngb)和線粒體參與LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受腦Ngb是新近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)中特異的攜氧球蛋白，與腦內(nèi)供氧密切相關(guān)，其主要以單體形式存在，含有151個氨基酸單鏈，分子量為17 kD。Ngb mRNA陽性細胞廣泛分布于腦皮質(zhì)，尤以顳葉聽區(qū)、扣帶皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)較為密集。陽性細胞主要是錐體細胞。Ngb對氧有很高的親和力，能夠可逆地結(jié)合氧，其能力高于血紅蛋白的攜氧能力。Li等〔16〕研究證實，LIP能明顯上調(diào)腦缺血模型中大鼠海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白的表達，同時可減少錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡，側(cè)腦室注射Ngb AS-ODNs能阻斷LIP的腦保護作用，而腹腔注射Ngb的誘導(dǎo)劑Hemin能模擬LIP的腦保護作用。此外，LIP有效增加了線粒體膜電位，增強線粒體Na+-K+-ATP酶活性、使線粒體超微結(jié)構(gòu)在腦缺血中得到了保護，并且LIP的此種保護效應(yīng)能部分被Ngb AS-ODNs所抑制或被Hemin所模擬。

3.4LIP通過抑制神經(jīng)元凋亡和減輕腦水腫誘導(dǎo)腦缺血耐受我室通過四血管閉塞全腦缺血動物模型，發(fā)現(xiàn)全腦缺血前給予LIP保護的大鼠，與全腦缺血組相比凋亡的神經(jīng)元數(shù)量明顯降低，腦組織含水量明顯減少，而LIP前側(cè)腦室注射p38 MAPK拮抗劑SB 203580后，可阻斷上述保護作用，說明LIP可以減輕腦缺血過程中的神經(jīng)元凋亡和腦水腫，從而發(fā)揮了腦保護作用，并且這種保護作用與p38 MAPK相關(guān)〔17〕。

4LIP誘導(dǎo)腦缺血耐受機制中存在的問題

雖然在LIP誘導(dǎo)腦缺血耐受的研究中做了大量的研究工作，觀察并發(fā)現(xiàn)了許多信號分子在其中的作用。但是，缺血預(yù)處理的肢體與遭受缺血打擊的大腦之間相隔較遠，由LIP啟動的保護性信號是通過何種途徑作用于腦的機制尚不完全清楚。

我室既往研究〔18〕發(fā)現(xiàn)，在LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)可阻斷LIP對腦缺血的保護作用，提示神經(jīng)途徑參與LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受。其可能途徑為LIP再灌注期間釋放介質(zhì)激活傳入神經(jīng)纖維，并傳至神經(jīng)中樞的相關(guān)部位，再經(jīng)傳出途徑后作用于腦內(nèi)，激活腦內(nèi)c-Fos等基因的表達，進一步誘導(dǎo)相關(guān)保護性基因的轉(zhuǎn)錄表達，達到對腦缺血的保護作用。國外學(xué)者研究指出，遠程雙下肢亞致死性缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)24 h內(nèi)的腦缺血耐受，這種保護作用在一定程度上可能是通過神經(jīng)源性途徑介導(dǎo)的〔19〕。此觀點認為遠端器官進行缺血預(yù)處理后，能激活局部的神經(jīng)通路，并傳到神經(jīng)中樞，再通過傳出神經(jīng)作用到相應(yīng)的靶器官，發(fā)揮保護作用。

在脊髓的缺血再灌注損傷模型中，雙側(cè)股動脈缺血10 min、再灌注10 min、循環(huán)2次的LIP能減輕家兔脊髓的缺血性損傷，于LIP前靜脈內(nèi)給予自由基清除劑二甲基硫脲(DMTU)能阻斷LIP的脊髓保護作用，而LIP前靜脈內(nèi)給予神經(jīng)節(jié)阻滯劑胺基己糖(HEX)卻對LIP的脊髓保護作用無明顯影響。上述結(jié)果提示LIP通過體液機制、而非神經(jīng)機制誘導(dǎo)了脊髓的缺血耐受〔20〕。此種觀點認為遠端器官進行缺血預(yù)處理后能產(chǎn)生一些物質(zhì)，這些物質(zhì)通過血流到達靶器官處，激活相應(yīng)受體并與之結(jié)合，啟動了多種細胞內(nèi)保護性信號，發(fā)揮對靶器官的保護作用。

此外，Lim等〔3〕在小鼠下肢LIP后心肌缺血模型中觀察到，阻斷股靜脈血流后，預(yù)處理的保護作用就會被消除，同時聯(lián)合切斷股神經(jīng)和坐骨神經(jīng)后，得到同樣的消除效果，但是分別阻斷股神經(jīng)和坐骨神經(jīng)后僅僅部分消除了預(yù)處理的保護作用，說明下肢LIP是有神經(jīng)和體液兩個通路共同完成保護作用，從而減少小鼠缺血心肌的梗死面積。

據(jù)此推測LIP也可能是通過神經(jīng)和(或)體液途徑發(fā)揮了腦保護作用，在以后的實驗中將進一步探討。

5小結(jié)與展望

有關(guān)LIP腦保護作用的機制尚未完全明確，仍需要大量的基礎(chǔ)研究與臨床實踐。但是，不可否認的是LIP為缺血性腦疾病提供了診療新思路，并且這種無創(chuàng)傷性的LIP具有易操作性、高安全性及患者易于接受等優(yōu)點，對臨床實踐具有重要的指導(dǎo)意義。如果能進一步明確LIP腦保護作用的機制，醫(yī)務(wù)工作者可以通過人工干預(yù)方式模擬其腦保護作用、減輕腦損傷，將其真正應(yīng)用于臨床，為患者帶來切實可行的保護。

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〔2015-10-11修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No.31100781)；河北省自然科學(xué)基金(No.C2011206040)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點項目(No.ZD2010135)；河北省衛(wèi)生廳資助項目(No.20090313)

通訊作者：孫曉彩(1976-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事缺血性腦病的研究。

〔中圖分類號〕R363

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2793-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.108

第一作者：王芳(1988-)，女，碩士，主要從事神經(jīng)病理生理學(xué)研究。