史雪萍，樊曉旭

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 外來病研究中心，山東 青島 266032）

提高DNA疫苗免疫效果研究進(jìn)展

史雪萍1，樊曉旭2

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 外來病研究中心，山東 青島 266032）

DNA疫苗本質(zhì)上是質(zhì)粒，包括真核表達(dá)載體和整合到載體上的表達(dá)特定基因的序列。DNA疫苗通過特定的遞送方式進(jìn)入宿主細(xì)胞核，載體攜帶的特定抗原基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，mRNA隨即至細(xì)胞漿，翻譯成抗原蛋白。不同于傳統(tǒng)的蛋白或多肽疫苗，DNA疫苗免疫宿主后，所表達(dá)的抗原（蛋白或多肽）能夠在基質(zhì)細(xì)胞（如肌肉細(xì)胞）和樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，這些抗原經(jīng)過處理，激活B淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，發(fā)揮體液免疫應(yīng)答效應(yīng)；抗原與MHC II和MHC I分子結(jié)合，經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞遞呈活化CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng)；此外，轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA本身同樣可能通過綁定胞漿內(nèi)非特異性的DNA識別受體，激活TBK1-STING通路，產(chǎn)生I型干擾素，誘導(dǎo)產(chǎn)生先天性免疫反應(yīng)，同時(shí)發(fā)揮佐劑效應(yīng)，促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答［1］。自1992年首次報(bào)道DNA疫苗研究以來，已有馬用西尼羅河熱DNA疫苗（West-Nile-Innovator）、魚用傳染性造血組織壞死病毒DNA疫苗（Apex-IHN）、犬用癌癥治療性DNA疫苗（Oncept）、提高仔豬存活率的生長激素基因治療性DNA疫苗獲得批準(zhǔn)上市［2］。但是，在實(shí)際應(yīng)用中，DNA疫苗往往因免疫效果差被廣為詬病，特別是DNA疫苗的免疫效果因不同物種而異。因此，如何提高DNA疫苗的免疫效果成為當(dāng)前DNA疫苗成功應(yīng)用的難點(diǎn)所在。文章擬從質(zhì)粒的提高目的基因表達(dá)、增強(qiáng)質(zhì)粒的遞送效果、模擬免疫佐劑效應(yīng)方面，介紹提高DNA疫苗免疫效果的研究進(jìn)展。

1　提高目的基因表達(dá)，增強(qiáng)免疫效果

在DNA疫苗的研制中，首先要考慮和選擇質(zhì)粒類型及其組成，包括其中啟動(dòng)子、篩選形式、復(fù)制方式，以保證質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量。DNA疫苗載體由負(fù)責(zé)表達(dá)轉(zhuǎn)入基因的真核區(qū)和提供選擇和復(fù)制的大腸桿菌原核區(qū)組成。其中，真核區(qū)包括了上游負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄成mRNA的啟動(dòng)子和下游介導(dǎo)mRNA剪切和多聚腺苷化的多聚腺苷信號（見中插彩版圖1）。啟動(dòng)子是在外源基因轉(zhuǎn)錄過程中首先和RNA聚合酶結(jié)合的一段DNA序列，與基因的轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)。通過比較了5種病毒和5種細(xì)胞啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性發(fā)現(xiàn)，將不同啟動(dòng)子分別插入同一載體中的熒光素酶啟動(dòng)子之前，在接種質(zhì)粒后，小鼠熒光素酶的表達(dá)情況有強(qiáng)弱之分，結(jié)果表明，他們啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力各不相同，因而對外源基因表達(dá)影響很大，巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子（CMV）較其他病毒和細(xì)胞啟動(dòng)子有著更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄作用，可提高基因持續(xù)表達(dá)的時(shí)間。多聚腺苷酸信號序列多源于兔子的β球蛋白或牛生長激素基因。

在載體中，通常加入Kozak序列，該序列是位于真核生物mRNA 5’端帽子結(jié)構(gòu)后面的一段核酸序列，多為“ACCACCAUGG”，該序列經(jīng)胞漿中的核糖體識別，可以與翻譯起始因子結(jié)合，從而介導(dǎo)mRNA的翻譯，促進(jìn)轉(zhuǎn)入基因進(jìn)行高效翻譯。在DNA疫苗設(shè)計(jì)中，往往加入信號肽，增強(qiáng)抗原遞呈效果，使抗原參與到不同的分泌系統(tǒng)，其中，可以選擇異源的分泌信號，也可根據(jù)分泌蛋白，選擇天然的信號肽。例如，使用優(yōu)化的組織型纖溶酶原激活劑（TPA）信號肽或IgE先導(dǎo)基因［1］。在某些DNA疫苗，使用的N-末端的泛素標(biāo)簽（末端泛素殘基G76A破壞融合蛋白）促進(jìn)MHC I類抗原呈遞，泛素（Ubiquitin，Ub）是一個(gè)由76個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)小分子，Ub與靶抗原基因的融合表達(dá)，可以使泛素化的靶抗原經(jīng)蛋白酶體降解為8～10個(gè)氨基酸小肽，這些短肽被迅速加工、處理和遞呈，并刺激機(jī)體MHC I類分子限制的特異性CD8+T淋巴細(xì)胞增殖、分化，從而誘發(fā)特異性的CTL反應(yīng)，達(dá)到增強(qiáng)DNA疫苗免疫效果的目的，但同時(shí)降低了抗體水平。在N末端插入供MHC I和MHC II類分子結(jié)合的多肽，將泛素與目的蛋白融合表達(dá)以增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，已成為核酸疫苗設(shè)計(jì)中的一條新思路。

2　增強(qiáng)質(zhì)粒在體內(nèi)的遞送效果，更好的促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答

目前，已開發(fā)了多種DNA遞送技術(shù)，包括金顆粒轟擊（基因槍），DNA無針噴射注射，DNA紋身，脂質(zhì)體包裹DNA經(jīng)皮電穿孔注射等。金顆粒轟擊是通過動(dòng)力系統(tǒng)將帶有基因的金屬顆粒，以一定的速度射進(jìn)細(xì)胞，由于小顆粒穿透力強(qiáng)，基因可直接進(jìn)入基因組，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的目的。早期研究發(fā)現(xiàn)，使用金粒子包裹DNA轟擊小鼠皮膚，提高了質(zhì)粒的傳遞效率。DNA噴流注射裝置Biojector 2000，無需針頭，通過產(chǎn)生極細(xì)高壓流穿透皮膚，將液體藥物遞送至體內(nèi)?？袢〔《竞怂嵋呙缃臃N中運(yùn)用了這種技術(shù)，通過在耳內(nèi)面噴射DNA，相比皮下或肌肉注射細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗Rabisin，可誘導(dǎo)產(chǎn)生更高滴度、更持久的病毒中和抗體。DNA紋身是另一種遞送DNA的方法，能夠促使基因在皮膚的表皮層和真皮層高效表達(dá)。這種方法相比肌肉注射DNA能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)的特異性細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答。此外，紋身過程會(huì)導(dǎo)致許多輕微的機(jī)械損傷，如出血，壞死，炎癥和皮膚再生，從而非特異性的刺激免疫系統(tǒng)。紋身方法免疫小鼠后，表現(xiàn)出的炎癥反應(yīng)更強(qiáng)烈。DNA疫苗臨床試驗(yàn)主要選擇肌肉注射和皮內(nèi)注射的方式［3］。但是，直接以裸DNA接種會(huì)有以下不足：僅有小部分肌細(xì)胞攝取DNA、DNA暴露與組織間的核酸酶攻擊下、DNA用量相對較大、必須加強(qiáng)免疫。而通過脂質(zhì)體接種包被的質(zhì)粒DNA，有利于抗原遞呈細(xì)胞的攝取，同時(shí)還能保護(hù)DNA免受核酸酶的攻擊。在HIV疫苗免疫獼猴實(shí)驗(yàn)中，用脂質(zhì)體包裹DNA免疫，要比使用5倍劑量裸DNA免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ELISA抗體高10～40倍［4］。通過豬和獼猴免疫實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，使用電穿孔方式經(jīng)皮膚免疫體積較大動(dòng)物可獲得更好的體液免疫和細(xì)胞免疫效果。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，人們使用層狀雙金屬氫氧化物二氧化硅納米顆粒包裹編碼新城疫病毒F基因的質(zhì)粒DNA，相比直接肌肉注射質(zhì)粒DNA，滴鼻免疫SPF雞，可達(dá)到更好的緩釋效果，同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞、體液、黏膜免疫反應(yīng)，攻毒保護(hù)效果更佳［5］。

3　模擬佐劑效應(yīng)、活化干擾素信號通路，提高疫苗免疫原性

在疫苗應(yīng)用中，尤其是滅活苗、蛋白質(zhì)亞單位疫苗，常添加佐劑，引起局部炎癥反應(yīng)、形成緩釋效應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。目前在已批準(zhǔn)上市的鳥用和犬用DNA疫苗中，使用了氫氧化鋁佐劑。在獲批上市的馬用WNV DNA疫苗，使用的是Meta Stim水包油佐劑［6］，但在DNA疫苗中使用氫氧化鋁佐劑的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，疫苗能夠顯著提高免疫小鼠的體液免疫水平，但在非人類的靈長類動(dòng)物體內(nèi)，這種免疫增強(qiáng)效果并不明顯；隨著宿主免疫機(jī)制研究的深入，人們進(jìn)一步確定了免疫DNA疫苗活化的信號通路，進(jìn)而提高疫苗的免疫效果。研究表明，在DNA疫苗中加入特定的CpG基序，可供宿主TLR9識別和活化，提高先天性免疫應(yīng)答效果，如使用陽離子脂質(zhì)體包被含有CpG基序的質(zhì)粒DNA免疫后可顯著增強(qiáng)肺部炎癥反應(yīng)［7］。在DNA疫苗免疫中，可同時(shí)使用免疫編碼“佐劑”蛋白的質(zhì)粒，如編碼IL-12、RANTES、CD40、免疫刺激RNA（isRNA）等，可提高疫苗的免疫效果。用含有流感HA片段的質(zhì)粒與表達(dá)MDA5的質(zhì)粒共同免疫雞，可提高對H5亞型流感感染的免疫保護(hù)［8］。

目前通過使用DNA疫苗免疫基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，TLR9、MyD88/TRIF、DAI、RIG-I和MDA5下游接頭分子IPS-1對于DNA疫苗免疫效果無影響，而小鼠分別缺失了STING、TBK1、IRF3和IFNαR2后，削弱了DNA疫苗的免疫效果。TBK1誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素包括了TLR依賴和TLR非依賴途徑。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STING，受到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各種dsDNA的活化，與TBK1一并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重新定位至核周小泡，最終與誘導(dǎo)的IκB激酶（IKK-i）將IRF3和IRF7磷酸化，活化IRF3/IRF3通路，刺激產(chǎn)生I型干擾素［9］。如將編碼TBK-1的質(zhì)粒和目的抗原質(zhì)粒各50 μg肌肉注射小鼠，能夠提高惡性瘧原蟲疫苗的體液免疫效果［10］。此外，小分子血管阻斷劑（DMXAA），模擬病毒感染產(chǎn)物dsDNA，在無TLRs和RNA解旋酶的參與下，僅通過TBK-1-IRF3信號通路誘導(dǎo)I型干擾素的大量產(chǎn)生。無獨(dú)有偶，抗病毒成分（CMA）能夠通過STING-TBK-1-IRF3誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素。ZBP1/ DAI，稱ZBP1，Z-DNA綁定蛋白1，也稱作DAI，DNA依賴的干擾素調(diào)控因子激活劑，或DLM-1，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該蛋白能夠直接綁定dsDNA，增強(qiáng)其與IRF3和TBK1的相互作用，激活DNA介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)［11］。但是，DAI作為胞內(nèi)DNA識別受體其功能尚存爭議，因?yàn)镈AI在DNA誘導(dǎo)干擾或免疫DNA質(zhì)粒后仍然能夠正常的產(chǎn)生干擾素，DAI在人體先天性免疫信號通路中的作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。近來研究發(fā)現(xiàn)，AIM2（黑色素瘤2缺失蛋白）、IFI16（γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16）、HMGB（高遷移率族蛋白B1）、TRIM56（三重基序蛋白56）、DDX41（為DEXDc解旋酶家族成員）、RNA聚合酶III、cGAS（環(huán)磷酸鳥苷-磷酸腺苷（cGAMP）合成酶）功能缺失會(huì)影響DNA誘導(dǎo)的I型干擾素的產(chǎn)生［12］。因此，DNA疫苗的佐劑效果主要依賴于干擾素發(fā)揮作用。

綜上，DNA疫苗作為新興的生物技術(shù)產(chǎn)品，其研究方興未艾，特別是目前在小鼠模型中取得了令人欣喜的結(jié)果。但在大動(dòng)物中該類疫苗免疫效果往往不佳。當(dāng)前，在DNA疫苗的設(shè)計(jì)和改進(jìn)上，人們重點(diǎn)考慮的是如何提高疫苗的遞送效率、增強(qiáng)抗原的表達(dá)和免疫原性，盡管研發(fā)道路依舊曲折而漫長，但隨著生物技術(shù)的發(fā)展和人們認(rèn)知的深入，DNA疫苗定會(huì)作為一種有力的“武器”，應(yīng)用于某些疾病的治療及傳染病的控制與根除中去。

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R 392.11

A

0529-6005（2016）09-0060-03

2016-03-18

史雪萍（1972-），女，高級獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)物生產(chǎn)及動(dòng)物疫病研究，E-mail：sapqdau@tom.com

樊曉旭，E-mail：fanxiaoxu@cahec.cn