黃 浩，趙 聰，陳貴堂

(中國藥科大學食品質量與安全教研室，南京 211198)

食物源蛋白肽鐵配合物的研究進展

黃 浩，趙 聰，陳貴堂

(中國藥科大學食品質量與安全教研室，南京 211198)

綜述食物源蛋白多肽鐵配合物的制備、分離純化、結構分析、生物活性以及安全性研究進展。

多肽鐵配合物；補鐵劑；缺鐵性貧血

全球大概有10%～30%的人存在缺鐵狀況，機體缺鐵會導致血紅蛋白合成受阻，從而引發(fā)缺鐵性貧血(IDA)[1]。缺鐵性貧血在人群中發(fā)生情況較為嚴重的是兒童、孕婦和成年婦女等人[2]。機體內的鐵主要來源于食物，但食物中的植物性鐵吸收利用率低[3]，因此，補鐵劑在預防和治療IDA 上有著非常重要的作用。高吸收率、高生物利用率且無胃腸道副作用的多肽鐵是治療缺鐵性貧血的理想補鐵劑。鐵元素經過配合反應后，是通過配位體的轉運吸收系統被機體吸收的。Ashmead等[4]研究證實，配合物中心的鐵元素是以整體的形式被小腸絨毛的刷狀緣直接吸收。多肽的轉運吸收系統具有能耗較低、轉運吸收速度較快和不容易被飽和等優(yōu)點[5]，因此，多肽鐵配合物憑借多肽的轉運吸收系統，能夠有效提高鐵在機體內的吸收利用率[6]。

利用化學合成法合成的多肽制備多肽鐵配合物不僅成本高，而且存在化學物質殘留等安全性問題[7]，因此，源于天然動植物蛋白的多肽具有較高的食用安全性和開發(fā)利用潛力。近年來，關于多肽鐵配合物的研究報道中，用于制備多肽鐵配合物的原料主要有大麥蛋白[8]、鷹嘴豆蛋白[9]、低值魚蛋白[10，11]、豬血蛋白[12，13]、芝麻蛋白[14]、豆粕蛋白[15]、魚鱗蛋白[16]、烏雞蛋白[17]和魚皮蛋白[18]等天然動植物蛋白。

1 食物源蛋白多肽鐵配合物的制備

1.1 酶解

多肽鐵配合物是將天然動植物蛋白酶解后得到的多肽，在一定溫度和pH等條件下與鐵元素經配位反應得到的一種生物活性物質。多肽的制備方法主要有生物酶解法、溶劑提取法和化學合成法。由于化學合成法和溶劑提取法存在操作步驟繁瑣、制備成本相對較高以及化學物質殘留等缺點，所以實際較少采用。大多數的研究報道采用條件更為溫和、制備成本相對較低和食用更加安全的生物酶解法來制備多肽鐵配合物。不同的蛋白酶解條件對后續(xù)的螯合反應以及螯合物的生物活性都有一定程度的影響。近年來的研究報道大都探索并優(yōu)化了酶解條件，以期獲得螯合能力和生物活性都較強的多肽。尋求最佳酶解工藝的研究，主要集中在最適酶的篩選、酶添加量、酶反應時間、酶反應溫度、酶反應pH值等影響因素上，并以多肽水解度和肽鐵螯合率為考察指標。林慧敏等[10]在帶魚蛋白多肽鐵配合物的制備中，采用了雙酶法酶解，并探究了酶添加量、酶解溫度、酶解時間和pH等酶解條件。Wu等[11]通過單酶篩選試驗發(fā)現，胰蛋白酶是制備鳀魚肌肉蛋白多肽鐵螯合物的最適酶，并且肽鐵螯合率與多肽的水解度有較大的相關性。潘風光等[12]研究發(fā)現，胰蛋白酶是酶解制備豬血多肽鐵配合物的最適酶。汪嬋等[14]在制備芝麻蛋白多肽鐵配合物的研究中發(fā)現，以胰蛋白酶為最適酶，在酶添加量為20 U/g、底物濃度為5%、酶解時間為5 h的最佳酶解條件下得到的芝麻蛋白多肽與鐵的螯合率可達90.9%。

1.2 螯合

在多肽與鐵離子的螯合反應過程中，大多是以二價鐵作為鐵源，鄭炯等[13]研究發(fā)現，二價鐵中以氯化亞鐵的螯合活性較好。為了避免二價鐵被氧化，需添加一定量的抗氧化劑，楊華等[15]通過對比試驗發(fā)現，抗壞血酸的抗氧化效果較好。pH值相對較低的條件下，溶液中的氫離子會與二價鐵離子競爭多肽中的供電子基團；pH值相對較高的條件下，溶液中的羥基易與二價鐵離子生成氫氧化鐵沉淀，因此，適宜的pH才能保證螯合反應的有效進行，由此可見，優(yōu)化多肽與鐵的螯合工藝顯得尤為重要。目前有關多肽鐵配合物螯合工藝的研究主要集中在pH值、多肽與鐵的質量比、反應時間和反應溫度等影響因素上，并且以肽鐵螯合率和螯合物得率為評價指標。

劉永等[16]在制備羅非魚鱗膠原蛋白多肽鐵配合物的研究中，通過響應面法優(yōu)化得到反應時間為41 min、反應溫度為40 ℃、pH值為5.4和肽鐵質量比為3∶1的最佳螯合工藝條件。宋莎莎等[17]得到了制備烏雞多肽鐵配合物的最佳工藝條件，即肽濃度為4%、pH值為5、肽鐵質量比為5∶1，并在最佳螯合反應條件下，測得螯合物得率為40.27 %、肽鐵螯合率為84.76 %。蔡冰娜等[18]在制備鱈魚皮膠原蛋白多肽鐵配合物的研究中，運用響應面法優(yōu)化得到了最佳螯合制備工藝：肽濃度為3.5%、肽鐵質量比為4∶1、pH值為7.0。楊華等[15]在以大豆豆粕為原料制備大豆多肽亞鐵配合物的研究中，在反應溫度30 ℃、pH值為4.0、肽鐵質量比1∶1、反應時間40 min的最佳螯合制備工藝條件下，螯合物得率可達46.49%、肽鐵螯合率可達86.60%。

2 食物源蛋白多肽鐵配合物的結構鑒定

2.1 分離純化

在蛋白酶解過程中，由于蛋白酶的非專一性，導致了未水解蛋白、氨基酸、多肽和多肽鐵配合物共存于多肽液中。為了進一步研究多肽鐵配合物的結構、機理和活性等，需先進行分離純化。利用無水乙醇等有機溶劑可以對螯合產物進行初步分離，然后通過鹽析法 、親和層析法、反相高效液相色譜法、超濾法、電泳法和凝膠色譜法等進行進一步分離純化。

Torres-Fuentes等[9]研究發(fā)現，通過親和層析和凝膠色譜法分離純化后的鷹嘴豆蛋白多肽的鐵螯合活性會增大，而且鐵螯合活性與多肽中組氨酸的含量成正相關性。Guo等[19]采用親和層析和反相高效液相法對鱈魚蛋白多肽鐵配合物進行分離純化，發(fā)現其中有一種三肽具有很強的鐵螯合活性。林慧敏等[20]采用超濾法對帶魚蛋白多肽鐵配合物進行了分級分離純化，得到了不同分子量的組分。de等[21]對甘蔗酵母提取物進行酶解，得到的多肽與鐵螯合，經過親和層析法分離純化后，多肽鐵配合物中賴氨酸和精氨酸的含量增加。Huang等[22]通過葡聚糖凝膠色譜和離子交換色譜對蝦蛋白多肽進行分離純化，結果發(fā)現分子質量為1～6 ku多肽的鐵螯合能力最強。劉文穎等[23]采用凝膠色譜對烏雞多肽鐵配合物進行分離純化，得到其分子量的分布圖譜。

2.2 結構分析

對分離純化后的多肽鐵配合物進行進一步的結構分析，可以通過紫外和紅外同時對多肽和多肽鐵配合物進行光譜分析，比較二者官能團吸收光譜的變化以及分析鑒定多肽鐵配合物的內部結構；還可采用氨基酸分析儀、質譜法以及液質聯用技術等鑒定多肽鐵配合物的分子量、氨基酸組成和序列結構。

黃賽博等[24]對帶魚蛋白多肽和螯合后的多肽鐵配合物進行了紫外和紅外光譜分析，經過配位反應后，紫外光譜分析結果顯示，氨基酸殘基吸收減小、肽鍵吸收增大，由此可知，螯合反應形成了和肽鍵相似的結構；紅外光譜分析發(fā)現，氨基吸收峰向高波方向發(fā)生位移，羰基吸收峰往低波方向發(fā)生位移，更加說明亞鐵離子與多肽的氨基和羧基形成了共價鍵。Lee等[25]通過液相與電噴霧質譜聯用技術確定了豬血蛋白多肽鐵配合物中多肽的氨基酸序列結構。Guo等[26]利用液質聯用技術，測定出鱈魚膠原蛋白經胰蛋白酶解后螯合活性較強的10個多肽的序列結構。張濱等[27]利用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜測定出豬血蛋白多肽鐵配合物的相對分子質量以及氨基酸序列結構。

3 食物源蛋白多肽鐵配合物的功能

3.1 多肽鐵是一種優(yōu)良的補鐵劑

補鐵劑主要有無機鐵、有機鐵、氨基酸鐵和多肽鐵。硫酸亞鐵等無機鐵較容易和日常飲食中的植酸等物質發(fā)生反應生成難溶性化合物，從而導致其在機體內吸收利用較差[28]。葡萄糖酸亞鐵等有機鐵比無機鐵的吸收利用率稍高，但和無機鐵一樣有鐵銹異味和對胃腸道刺激大。在機體內，氨基酸鐵的吸收利用率是硫酸亞鐵的2倍左右[29]，并且在小腸中直接以螯合物的形式被整體吸收[30]。由于小腸粘膜細胞上有吸收多肽的載體[31]，多肽鐵可以被腸粘膜細胞直接吸收進入機體組織，而且與氨基酸相比，多肽的吸收效率更高且不易飽和，例如二肽和三肽的吸收速度高于同一組份的氨基酸[32]。多肽鐵是一種生物態(tài)鐵劑，沒有胃腸道刺激等副作用和異味，具有高生物利用度和吸收率，且對缺鐵性貧血有顯著防治效果，故而是一種優(yōu)良的補鐵劑。鄭炯等[33]通過對比研究發(fā)現，豬血蛋白多肽鐵配合物可以明顯改善大鼠的缺鐵性貧血，并且其補鐵效果遠遠優(yōu)于氯化亞鐵和葡萄糖酸亞鐵。

3.2 多肽鐵的生物活性

3.2.1 免疫活性 補鐵劑在改善機體缺鐵狀況的同時，還具有一定的免疫調節(jié)作用[34]。馮國強等[35]研究發(fā)現，在飼料中添加80、120 mg/ kg甘氨酸亞鐵和160 mg/ kg硫酸亞鐵均能促進42日齡肉雞胸腺的發(fā)育；此外，添加 120 mg/kg和160 mg/ kg甘氨酸亞鐵能顯著提高21 d齡肉雞血清免疫球蛋白的含量。王曉玲等[36]通過動物試驗來研究了多肽鐵配合物的免疫活性，將不同濃度的帶魚蛋白多肽鐵配合物加進小龍蝦的飼料中，在帶魚蛋白多肽鐵配合物的濃度為200 mg/kg和400mg/kg的條件下喂養(yǎng)30d后，發(fā)現小龍蝦的生長性能指標和非特異性免疫酶的活力并無明顯提高；在800mg/kg以上的高濃度條件下喂養(yǎng)60 d后，發(fā)現小龍蝦的生長性能和非特異性免疫酶活力等均明顯增強。

3.2.2 抗氧化活性 鐵是機體內過氧化氫酶等含鐵酶類的重要組成成分，有研究表明有些多肽存在抗氧化活性，這些多肽與鐵螯合后能夠保留一定程度的活性，如抗氧化活性[37]。呂瑩等[38]研究發(fā)現，核桃肽與鐵螯合活性越大，其抗氧化能力也會越強，這可能是亞鐵離子與多肽中的酪氨酸和組氨酸等結合，而這些氨基酸對多肽鐵配合物的抗氧化起著重要作用[39]。林慧敏等[40]研究發(fā)現，梅童魚蛋白多肽鐵配合物清除羥自由基的作用較強，而馬鮫魚蛋白多肽鐵配合物清除DPPH自由基的作用較強。此外，Cian等[41]研究發(fā)現，紅藻蛋白多肽鐵配合物同時具有抗氧化和防齲齒活性。汪學榮等[42]研究發(fā)現，豬血多肽鐵配合物的抗氧化能力強于豬血多肽而弱于維生素C，并且豬血多肽鐵配合物清除過氧化氫和超氧陰離子的能力都很強。謝超等[43]將帶魚蛋白多肽鐵配合物經不同濃度的無水乙醇沉淀，研究顯示，抗氧化能力最強的是經50%無水乙醇沉淀獲得的組分。

3.2.3 抗菌活性 不同來源的多肽鐵配合物具有不同程度的抗菌活性，其抗菌譜也并不相同。帶魚蛋白多肽鐵配合物對枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等都具有一定的抑制作用，具有較為廣譜的抗菌活性，尤其對巨大芽胞桿菌的抑制效果最佳[44]。謝超等[43]將帶魚蛋白多肽鐵配合物經不同濃度的無水乙醇沉淀，研究顯示，抑菌能力最強的是經80%無水乙醇沉淀得到的組分，且具有較為廣譜的抗菌活性。林慧敏等[40]研究發(fā)現，馬鮫魚蛋白多鐵配合物沒有明顯的抗菌活性，而帶魚蛋白多肽鐵配合物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌都存在明顯的抑菌能力。

4 食物源蛋白多肽鐵配合物的安全性評價研究

多肽鐵配合物作為一類新的補鐵劑，需科學地評價其食用的安全性。汪學榮等[45]通過小鼠急性毒性和大鼠喂養(yǎng)30 d的試驗來評價豬血多肽鐵配合物的安全性，結果表明小鼠在灌喂豬血多肽鐵配合物后無明顯的毒性反應，喂養(yǎng)30 d后大鼠的血液生化指標、行為活動和生長發(fā)育都表現為正常。王麗霞等[46]研究發(fā)現，豬血多肽鐵配合物和Na-Fe-EDTA均能顯著改善缺鐵性貧血狀況，而且豬血多肽鐵配合物的療效遠遠好于Na-Fe-EDTA；此外，給小鼠不斷灌胃大劑量的豬血多肽鐵配合物后，小鼠的行為活動表現依舊正常，臟器也不存在異常。因此，多肽鐵配合物作為優(yōu)良的補鐵劑長期口服安全有效，不會產生明顯的毒副作用。

5 結論

目前，食物源蛋白多肽鐵配合物的研究主要集中在制備工藝條件的優(yōu)化以及生物活性研究，有關食物源蛋白多肽鐵配合物的安全性研究報道較少，且其活性機制不清楚，以后有必要深入研究其生物活性與內在結構之間的關系。后續(xù)研究重點不僅可以優(yōu)化制備工藝和研究活性機理，而且可以將更多不同來源的動植物，特別是食品加工下腳料應用于多肽鐵配合物的研究中，提高資源的綜合利用率。隨著后續(xù)研究的不斷深入以及相應技術的發(fā)展，食物源蛋白多肽鐵配合物勢必將發(fā)揮出其巨大的潛力。◇

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(責任編輯 李燕妮)

Research Progress of Polypeptide Iron Chelate from Food Protein

HUANG Hao，ZHAO Cong，CHEN Gui-tang

(Department of Food Quality and Safety，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China)

This paper reviewed research progress on the preparation，separation and purification，structural analysis，biological activity and safety of polypeptide iron chelate from food protein.

polypeptide iron chelate；iron supplement；iron deficiency anemia(IDA)

中國藥科大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費重點項目(項目編號：2016ZZD001)。

黃浩(1993— )，男，在讀碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)與功能食品學。

陳貴堂(1977— )，男，博士，副教授，研究方向：食品化學與營養(yǎng)學。