李傳民,曹 健,張慧茹*,蘭亞莉

(1．河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

絞股藍(lán)內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

李傳民1,曹 健1,張慧茹1*,蘭亞莉2

(1．河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

藥用植物絞股藍(lán)內(nèi)生真菌JY25胞外多糖具有抗癌、抗氧化等多種活性作用，對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期達(dá)到高產(chǎn)胞外多糖的效果。以胞外多糖產(chǎn)量為檢驗指標(biāo)，采用單因素和正交試驗對培養(yǎng)時間、接種量、碳源、氮源進行優(yōu)化。單因素試驗結(jié)果表明，絞股藍(lán)內(nèi)生真菌JY25產(chǎn)胞外多糖的最佳培養(yǎng)周期為8 d，最佳接種量為7%，最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母粉；正交試驗優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)胞外多糖的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)時間8 d、接種量5%、葡萄糖添加量40 g/L、酵母粉添加量5 g/L，在此條件下胞外多糖的產(chǎn)量達(dá)到271.40 mg/L。

絞股藍(lán)； 內(nèi)生真菌； 胞外多糖； 發(fā)酵條件； 優(yōu)化

真菌多糖具有天然藥物活性和特殊的保健功能，已成為生物學(xué)、食品科學(xué)、醫(yī)藥科學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點[1]。絞股藍(lán)(Gynostemmapentaphyllum)為葫蘆科多年生蔓生草本植物，內(nèi)含有皂苷、多糖、黃酮、有機酸、生物堿等多種活性成分，具有益氣健脾、化痰止咳、清熱解毒等多種功效[2]。河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院動物生理實驗室從絞股藍(lán)中分離到1株具有高抑菌活性的內(nèi)生真菌JY25，同時，研究發(fā)現(xiàn)該菌株的胞外多糖具有較好的抗氧化、抗腫瘤、抑菌等作用[3]，具有很好的應(yīng)用前景。目前,國內(nèi)外尚無關(guān)于絞股藍(lán)內(nèi)生真菌胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化的研究報道。為此，本研究采用單因素和正交試驗對分離出的絞股藍(lán)內(nèi)生真菌JY25產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，旨在為絞股藍(lán)內(nèi)生真菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)研究及批量生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 絞股藍(lán)內(nèi)生真菌JY25菌株：由河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院動物生理實驗室分離鑒定。

1.1.2 試驗用培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，切碎，水煮沸20 min，取上清，加葡萄糖20 g、瓊脂糖15～20 g，定容至1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，切碎，水煮沸20 min，取上清，加葡萄糖20 g、定容至1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、酵母粉3 g/L。

1.1.3 主要儀器 721分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、快速混勻器(金壇市華峰儀器有限公司)、生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 采用苯酚-硫酸法制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]。將葡萄糖置于105 ℃烘箱中，烘干至恒質(zhì)量，精確稱取烘干的葡萄糖0.255 g，蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液母液。精確量取10 mL母液移至250 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至250 mL，即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。取6支試管，用移液槍分別加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，并用蒸餾水補足至2 mL。在每只試管中分別加入1 mL 5 %的苯酚和5 mL濃硫酸。在漩渦振蕩器上振蕩均勻，靜置20 min。以不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)液作為空白對照調(diào)零，測490 nm下的吸光度值(x)，獲得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.010x-0.002，R2=0.999，y為葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.2.2 胞外多糖含量的測定 將發(fā)酵液抽濾去除菌絲體，在60 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將發(fā)酵液濃縮至原體積的1/5，加入4倍發(fā)酵液體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，3 000 r/min離心10 min，取沉淀，即為發(fā)酵胞外多糖。用蒸餾水將其溶解至250 mL容量瓶中并定容。取1 mL加入試管中，以苯酚-硫酸法測定其在490 nm處吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得胞外多糖含量。

1.2.3 種子液的制備 取斜面保存的JY25菌種轉(zhuǎn)接到PDA平板，28 ℃活化培養(yǎng)4 d。將長勢良好的菌絲轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)4 d，用直徑約0.5 cm的打孔器取菌餅3塊，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min培養(yǎng)4 d，加入適量玻璃珠和磁轉(zhuǎn)子攪拌30 min，將菌絲球打碎，作為種子液接種。

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 培養(yǎng)時間 使用250 mL三角瓶分裝100 mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，接種3%的種子液，26 ℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔1 d抽取培養(yǎng)液，檢測胞外多糖產(chǎn)量，培養(yǎng)14 d，確定產(chǎn)胞外多糖的最適培養(yǎng)時間。

1.2.4.2 接種量 使用250 mL三角瓶分裝100 mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，分別接種1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%的種子液，26 ℃、150 r/min培養(yǎng)一段時間(1.2.4.1確定的最適培養(yǎng)時間)，檢測胞外多糖產(chǎn)量，確定產(chǎn)胞外多糖的最適接種量。

1.2.4.3 碳源 在上述優(yōu)化試驗的基礎(chǔ)上，以3 g/L的酵母粉為唯一氮源，分別選用30 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、淀粉為碳源進行優(yōu)化，26 ℃、150 r/min培養(yǎng)，檢測胞外多糖產(chǎn)量，確定產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)碳源。

1.2.4.4 氮源 在上述優(yōu)化試驗的基礎(chǔ)上，分別選用3 g/L的酵母粉、蛋白胨、尿素、胰蛋白胨、黃豆餅粉、硝酸鈉、硫酸氨為氮源進行優(yōu)化，26 ℃、150 r/min培養(yǎng)，檢測胞外多糖產(chǎn)量，確定產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)氮源。

1.2.5 正交試驗 依據(jù)單因素試驗結(jié)果，對絞股藍(lán)內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件中的培養(yǎng)時間、接種量、葡萄糖添加量、酵母粉添加量進行四因素三水平正交試驗L9(34)，以優(yōu)化產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件，試驗設(shè)計見表1。

表1 絞股藍(lán)內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件的

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均用SPSS 8.1進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍(lán)內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)時間 由圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的推移，胞外多糖產(chǎn)量逐漸增加，在8 d時達(dá)到最大(192.10 mg/L)，之后隨著時間的延長而逐漸降低。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是隨著菌體的生長，胞外多糖逐漸積累，而當(dāng)培養(yǎng)基中的原始碳源逐漸被消耗后，菌體的繼續(xù)生長則利用代謝產(chǎn)生的胞外多糖作為二次碳源，從而出現(xiàn)胞外多糖產(chǎn)量下降的現(xiàn)象。因此，最佳培養(yǎng)時間為8 d。

圖1 培養(yǎng)時間對絞股藍(lán)內(nèi)生真菌胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.1.2 接種量 由圖2可知，接種量在3%～9%時，胞外多糖產(chǎn)量都比較高，接種量為7%時，胞外多糖產(chǎn)量最高，所以最佳的接種量為7%。

2.1.3 碳源 由圖3可知，以葡萄糖為碳源時，胞外多糖產(chǎn)量最高，顯著高于其他碳源，其他碳源之間差異相對較小，這可能是因為葡萄糖最容易被JY25吸收，所以葡糖糖為最佳碳源。

圖3 碳源對絞股藍(lán)內(nèi)生真菌胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.1.4 氮源 從圖4可以看出，以酵母粉為氮源時，胞外多糖產(chǎn)量顯著高于其他氮源，蛋白胨、黃豆餅粉次之，其他4種氮源差異較小。這可能是因為酵母粉中的氮來源于真菌蛋白，更容易被真菌吸收利用。由此確定，JY25發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最佳氮源為酵母粉。

圖4 氮源對絞股藍(lán)內(nèi)生真菌胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.2 絞股藍(lán)內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件的正交試驗結(jié)果

由表2可以看出，各因素對絞股藍(lán)內(nèi)生真菌JY25胞外多糖產(chǎn)量的影響順序為酵母粉添加量>培養(yǎng)時間>接種量>葡萄糖添加量；通過方差分析(表3)進一步發(fā)現(xiàn)，酵母粉添加量對胞外多糖產(chǎn)量影響顯著，其他因素影響均不顯著。絞股藍(lán)內(nèi)生真菌JY25產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B1C3D3，即培養(yǎng)時間8 d、接種量5%、葡萄糖添加量40 g/L、酵母粉添加量5 g/L(表2)。

表2 絞股藍(lán)內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件的

表3 絞股藍(lán)內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件的方差分析結(jié)果

注：*表示顯著(P<0.05)。

2.3 絞股藍(lán)內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖最優(yōu)發(fā)酵條件的驗證試驗結(jié)果

按照正交試驗所得的最優(yōu)發(fā)酵條件進行發(fā)酵，3次重復(fù)的胞外多糖產(chǎn)量分別為269.04、271.12、274.03 mg/L，平均為271.40 mg/L，高于表2中所有結(jié)果。表明經(jīng)過優(yōu)化，確實提高了絞股藍(lán)內(nèi)生真菌JY25胞外多糖的產(chǎn)量。

3 結(jié)論與討論

真菌多糖具有特異的免疫活性，但通常含量比較低。韓苗苗等[5]對白玉菇等4種食用真菌多糖含量的比較研究顯示：杏鮑菇的多糖含量最高為52.38%，口蘑的多糖含量最低只有15.63%。因此，對藥用植物內(nèi)生真菌體外高產(chǎn)多糖的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，具有非常重要的意義。

微生物合成次級代謝產(chǎn)物的能力與培養(yǎng)條件緊密相關(guān)，其直接影響代謝方式及代謝物產(chǎn)量，從而影響目的產(chǎn)物產(chǎn)量[6]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對內(nèi)生菌相關(guān)活性成分發(fā)酵條件的優(yōu)化研究方法很多，包括正交優(yōu)化[7]、響應(yīng)面優(yōu)化[8]、Plackett-Burman設(shè)計[9]等。本試驗采用單因素試驗和正交試驗對絞股藍(lán)內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)時間、接種量、碳源、氮源進行優(yōu)化，最終確定了絞股藍(lán)內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖的最佳發(fā)醇條件：培養(yǎng)時間8 d、接種量5%、葡萄糖添加量40 g/L、酵母粉添加量5 g/L，在此條件下胞外多糖的產(chǎn)量達(dá)到271.40 mg/L。為下一步制取精制多糖、檢測多糖結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系研究提供充足的原材料。

[1] 郭天力,嚴(yán)曉娟,胡先望,等.真菌多糖研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2013,13(18):3578-3583.

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Optimization of Fermentation Conditions of Extracellular Polysaccharide Produced by Endophytic Fungi fromGynostemmapentaphyllum

LI Chuanmin1,CAO Jian1,ZHANG Huiru1*，LAN Yali2

(1.College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001，China; 2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

Extracellular polysaccharide produced by endophytic fungi JY25 from the medicinal plantsGynostemmapentaphyllumhad anti-cancer,anti-oxidation and other bioactive effects.The fermentation conditions were optimized to obtain the highest EPS.The incubation time,inoculum dose,carbon sources and nitrogen sources were optimized by single factor test and the orthogonal test with the yield of extracellular polysaccharide as the test aim.The optimized results of single factor test showed that the optimum culture cycle was 8 d,the optimum inoculum dose was 7%,the optimum carbon source was glucose,and the optimum nitrogen source was yeast powder.The optimized results of orthogonal test indicated that the optimum culture cycle was 8 d,the optimum inoculum dose was 5%,the optimum application rate of glucose was 40 g/L,and the optimum application rate of yeast powder was 5 g/L,under the above conditions the yield of extracellular polysaccharide reached 271.40 mg/L.

Gynostemmapentaphyllum； endophytic fungi; extracellular polysaccharide； fermentation conditions； optimization

2015-07-02

河南省教育廳自然科學(xué)項目科學(xué)技術(shù)重點研究項目(15A180013)

李傳民(1990-)，男，河南信陽人，在讀碩士研究生，研究方向：真菌多糖構(gòu)效關(guān)系。E-mail：952686964@qq.com

*通訊作者：張慧茹(1967-)，女，河北鹿泉人，副教授，博士，主要從事藥用中草藥研究。E-mail：zhr67@163.com

TS201；TQ920

A

1004-3268(2016)01-0143-04