水飛薊賓對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移的作用研究

陳惠云 王少珍 廖聯(lián)明

·論著·

水飛薊賓對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移的作用研究

陳惠云 王少珍 廖聯(lián)明

目的 觀察水飛薊賓對(duì)人肝癌（HCC）HepG2細(xì)胞遷移的作用。方法 采用MTT法觀察水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法觀察水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的作用，通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)遷移相關(guān)基因Twist、Snail和Slug的表達(dá)水平；采用單因素方差分析方法比較不同濃度水飛薊賓對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移距離的和遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)的影響，并比較各組間Twist、Snail和Slug的轉(zhuǎn)率。結(jié)果 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示不同濃度（0，30，60，120，240，480 μg/ml）水飛薊賓可以不同程度地抑制HepG2細(xì)胞增殖，同時(shí)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)（P ＜ 0.05）；與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞在劃痕24 h后，水飛薊賓組（60，120，240 μg/ml）的遷移距離分別為（1.50±0.24）cm（P = 0.046）、（1.20±0.33）cm（P = 0.037）和（1.05±0.24）cm（P = 0.029）；Transwell實(shí)驗(yàn)中水飛薊賓組（60，120和240 μg/ml）細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)分別為（100.00±4.25）個(gè)、（30.00±5.34）個(gè)和（6.00±2.28）個(gè)（P均 ＜ 0.05）；PCR結(jié)果顯示，水飛薊賓不同程度的降低HepG2細(xì)胞Snail、Slug和Twist基因的轉(zhuǎn)率。結(jié)論 水飛薊賓可抑制人HCC HepG2細(xì)胞的遷移。

水飛薊素； 肝腫瘤； 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球所有惡性腫瘤的第6位，病死率排在第3位，5年生存率不到5％[1]。轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是HCC致死的主要原因[2]。雖然科學(xué)界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)的機(jī)制[3-6]，但HCC的發(fā)病機(jī)制至今并不十分清楚。

水飛薊賓（silybin）是菊科水飛薊（silybum marianum L.Gaertn）種子中提取的黃酮類(lèi)化合物，具有保肝、降血脂、抗氧化、防止糖尿病、保護(hù)心肌、抗血小板聚集和抗腫瘤等生理作用[7]。研究表明水飛薊賓還具有抗腫瘤活性，對(duì)于多種腫瘤均具有良好的抑制作用[8-11]。另外，水飛薊賓還可以抑制表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和轉(zhuǎn)移[12]。因此，課題組推測(cè)水飛薊賓對(duì)HCC轉(zhuǎn)移可能有抑制作用。本研究以人HCC細(xì)胞株（HepG2）為模型，觀察水飛薊賓對(duì)HepG2人HCC細(xì)胞遷移的作用，為開(kāi)發(fā)水飛薊賓用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.腫瘤細(xì)胞株：人HCC HepG2細(xì)胞株為福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存。

2.主要試劑及儀器：水飛薊賓[天津天士力制藥集團(tuán)股份有限公司（H37023385）]，二甲亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品），四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）；High-DMEM（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）、磷酸緩沖液（PBS）、4％臺(tái)盼藍(lán)、引物（上海捷瑞生物工程有限公司）、Trizol（美國(guó)Nitrogen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）、2xTaq Mix、焦碳酸二乙醋 （diethy pyrocarbonate，DEPC）（美國(guó)Sigma公司）、Gold View核酸染料、TBE Buffer、DNA marker。使用儀器包括ELX800酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）、PCR分析儀（德國(guó)Eppendorf公司）、電泳儀（美國(guó)Bio-rad公司）和全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad公司）

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：HepG2重懸于含有10％胎牛血清的high-DMDE培養(yǎng)液中并添加100 μg/ml青霉素和100 U/ml硫酸鏈霉素。放于37 ℃、5％ CO2、95％濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)90％～100％匯合時(shí)，用0.125％胰蛋白酶+ 0.01％EDTA常規(guī)消化，細(xì)胞按1∶3比例進(jìn)行傳代。所有實(shí)驗(yàn)均使用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

2. MTT法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化，重懸計(jì)數(shù)后，均以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔100 μl。于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞融合度達(dá)50％～ 60％時(shí)，棄上清液，分別加入不同濃度水飛薊賓（0，30，60，120， 240，480 μg/ml）干預(yù)24，48，72 h，小心吸棄上清液，每孔加0.5 mg/ml MTT 100 μl，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄MTT溶液（注意不要吸走孔底部的藍(lán)紫色結(jié)晶），每孔加入DMSO 100 μl，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育10 min，振蕩器上充分振蕩至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，經(jīng)全自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度（A）值。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（％）=實(shí)驗(yàn)組（A）值/對(duì)照組（A）值×100％。

3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化，重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)95％以上時(shí)，用10 μl的無(wú)菌移液器吸頭在板孔底部沿直尺作直線形劃痕，吸去培養(yǎng)液，PBS洗2遍，小心洗去被劃下的細(xì)胞，各孔加入新的含或不含水飛薊賓的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)（0，60，120，240 μg/ml），此時(shí)記為0 h，分別在劃痕后0，12，24 h于倒置顯微鏡下觀察、拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4. Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：同前所述，細(xì)胞經(jīng)傳代，接種及不同濃度水飛薊賓干預(yù)（0，60，120，240 μg/ml）48 h后，0.25％胰蛋白酶消化，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗2遍，Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，取100 μl加入上層小室，下層小室加750 μl含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h。將Transwell小室從24孔板中取出，用移液槍吸出小室上層培養(yǎng)液，用棉簽頭擦去上室未遷移的細(xì)胞，將小室置于4％ 多聚甲醛溶液中固定15 min，用PBS輕輕蕩洗，0.1％的結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次，洗去多余的結(jié)晶紫染液，晾干，于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行拍照（×200），統(tǒng)計(jì)遷移的細(xì)胞數(shù)。

5. PCR反應(yīng)：胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種于6孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度為50％～60％時(shí)，不同濃度水飛薊賓（0，60，120，240 μg/ml）干預(yù)48 h，用Trizol提取總RNA，取1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，逆轉(zhuǎn)錄選20 μl體系，各組樣品均取1 μg Total RNA。置于Bio-rad PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃，30 min；85℃，5 min。所得cDNA產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆?。作為?nèi)參的3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的引物為5-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3和5-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3，Snail基因的引物為5-CTCCACGAGGTGTGACTAACTA-3和5-CCGACAAGTGACAGCCATTAC-3，Slug基因的引物為5-CTTCAAGGACACATTAGAACTCACA-3和5-CTACACAGCAGCCAGATTCC-3，Twist基因的引物為5-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3和5-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3。PCR總體系25 μl，按94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃ 2 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)電泳分析，觀察藥物處理后Snail、Slug和Twist基因表達(dá)的變化。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。水飛薊賓干預(yù)后細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移距離、細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)以及Snail、Slug和Twist基因的相對(duì)表達(dá)量均以± s表示，多組比較采用單因素方差分析，以P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

HepG2細(xì)胞在含有不同濃度水飛薊賓（0，30，60，120，240，480 μg/ml）的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24，48，72 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，如表1所示，HepG2細(xì)胞活力隨水飛薊賓濃度增加而降低，同時(shí)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)（P ＜ 0.05）。由于30 μg/ml的水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用不明顯，所以其余細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均選擇60，120，240 μg/ml的水飛薊賓干預(yù)，另外藥物干預(yù)48 h的效果較24 h明顯，所以其他實(shí)驗(yàn)選擇干預(yù)48 h后進(jìn)行檢測(cè)。

表1 不同濃度水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響（％，± s，n = 6）

表1 不同濃度水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響（％，± s，n = 6）

藥物濃度（μg/ml）24 h48 h72 h 0 100.00±4.10100.00±4.22100.00±4.21 30115.13±5.03105.31±5.00100.05±0.62 60100.88±4.02 90.33±3.89 80.50±3.42 120 95.85±3.04 85.29±3.01 66.75±2.87 240 85.70±3.01 61.12±2.87 37.25±1.31 480 75.73±2.63 52.68±1.88 25.38±1.00 F值10.12650.345 77.789 P值 0.053 0.024＜ 0.001

二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1和表2所示，對(duì)照組的HepG2細(xì)胞在劃痕24 h后，劃痕距離明顯變窄，不同濃度水飛薊賓（0，60，120，240 μg/ml）干預(yù)的HepG2細(xì)胞的劃痕愈合能力明顯弱于對(duì)照組，即細(xì)胞的遷移能力明顯減弱，且細(xì)胞遷移能力隨藥物濃度的增大而降低?？梢?jiàn)水飛薊賓可以抑制HepG2細(xì)胞的遷移。

三、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Transwell通過(guò)檢測(cè)一段時(shí)間穿過(guò)小孔膜的細(xì)胞數(shù)來(lái)反映細(xì)胞遷移能力，穿過(guò)小孔膜的細(xì)胞數(shù)越多，迀移能力越強(qiáng)。結(jié)果如圖2和表3所示。在遷移實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組有較多的HepG2細(xì)胞穿過(guò)微孔膜，水飛薊賓干預(yù)后穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P均＜ 0.05），且藥物劑量越大，穿過(guò)孔膜的細(xì)胞數(shù)越少。表明水飛薊賓可以顯著降低HepG2的遷移能力。

表2 不同干預(yù)時(shí)間下水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞遷移距離的影響（cm，± s，n = 3）

表2 不同干預(yù)時(shí)間下水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞遷移距離的影響（cm，± s，n = 3）

藥物濃度（μg/ml）12 h24 h 0 0.80±0.241.50±0.24 60 0.70±0.251.20±0.33 1200.60±0.341.05±0.24 240 0.40±0.280.75±0.26 F值3.464 37.648 P值0.052 0.029

表3 水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)的影響（± s）

表3 水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)的影響（± s）

藥物濃度（μg/ml）n細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)（個(gè)）0 3 150 60 3100.00±4.25 1203 30.00±5.34 240 3 6.00±2.28 F值182.450 P值 ＜ 0.001

四、水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞Snail、Slug和Twist基因的影響

如表4，HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度水飛薊賓（0，60，120，240 μg/ml）干預(yù)48 h后Snail、Slug和Twist基因表達(dá)量均降低。由此可知，水飛薊賓可使HepG2細(xì)胞的Snail、Slug和Twist基因表達(dá)下調(diào)（P均＜ 0.05）。

討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，而細(xì)胞的遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要表現(xiàn)[13]。因此，開(kāi)發(fā)新的抑制細(xì)胞遷移的藥物對(duì)治療腫瘤轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。開(kāi)發(fā)新藥的來(lái)源之一是天然藥物[14]。水飛薊賓是一種天然藥物，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)于多種腫瘤均具有良好的抑制作用[8-11]。

圖 1 倒置顯微鏡下觀察水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （×100）

圖 2 倒置顯微鏡下觀察水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響 （結(jié)晶紫染色×200）

表4 HepG2細(xì)胞對(duì)Snail、Slug和Twist基因表達(dá)量的影響（n = 3，± s）

表4 HepG2細(xì)胞對(duì)Snail、Slug和Twist基因表達(dá)量的影響（n = 3，± s）

藥物濃度（μg/ml）SnailSlugTwist 0 2.244±0.0841.704±0.1101.431±0.210 60 1.677±0.0531.353±0.0751.132±0.620 1201.494±0.0321.160±0.0680.913±0.068 2401.577±0.0441.173±0.0560.857±0.054 F值4.3444.496 43.689 P值0.0270.028＜ 0.001

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)觀察水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水飛薊賓可以抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并且隨著藥物濃度和時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)研究水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的抑制作用。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥24 h后水飛薊賓組HepG2細(xì)胞的愈合能力比未用藥組高，并具有濃度依賴(lài)性，因此可以推測(cè)水飛薊賓具有抑制HepG2細(xì)胞遷移的趨勢(shì)，但這種方法只是定性的分析。為了進(jìn)一步確定水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的影響，采用Transwell進(jìn)行定量研究，Transwell方法是通過(guò)檢測(cè)一段時(shí)間內(nèi)穿過(guò)小孔膜的細(xì)胞數(shù)來(lái)觀察細(xì)胞遷移能力的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度的水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞的遷移有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)。

本研究通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)觀察水飛薊賓對(duì)轉(zhuǎn)移相關(guān)因子Snail、Slug和Twist的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水飛薊賓干預(yù)48 h后HepG2細(xì)胞的Snail、Slug和Twist基因表達(dá)明顯下調(diào)，并且有劑量依賴(lài)效應(yīng)。由于Snail、Slug和Twist等基因參與細(xì)胞的EMT，因此水飛薊賓是否會(huì)抑制EMT值得進(jìn)一步研究。EMT對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移非常關(guān)鍵[15-19]。Slug和Twist參與調(diào)控乳腺癌的EMT[18]。Snail參與調(diào)控多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[20-23]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水飛薊賓對(duì)Snail、Slug和Twist等基因的影響，對(duì)開(kāi)發(fā)抑制HCC轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)抑制劑顯得尤為重要[24-26]。因此，在接下來(lái)的研究中將繼續(xù)深入研究水飛薊賓與HCC細(xì)胞EMT的關(guān)系。

綜上所述，水飛薊賓具有抑制人HCC HepG2細(xì)胞遷移的能力，為水飛薊賓臨床抗腫瘤的應(yīng)用提供了新的理論基礎(chǔ)和前景。同時(shí)，水飛薊賓可以抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)因子Snail、Slug和Twist的表達(dá)又為開(kāi)發(fā)HCC轉(zhuǎn)移抑制劑提供新的思路和基礎(chǔ)。水飛薊賓可以抑制EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)變[12]。但是，本實(shí)驗(yàn)只是初步研究水飛薊賓對(duì)EMT相關(guān)因子Snail、Slug和Twist基因表達(dá)的影響，未對(duì)細(xì)胞EMT的標(biāo)志物E鈣黏蛋白與波形蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，因此水飛薊賓是否是通過(guò)逆轉(zhuǎn)HCC細(xì)胞EMT或通過(guò)其他通路來(lái)調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞遷移的機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步研究。

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Silybin inhibits migration of human hepatocellular carcinoma cells and its mechanism

Chen Huiyun, Wang Shaozhen, Liao Lianming. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, China

Liao Lianming, Email:llm@fjtcm.edu.cn

Objective To observe the effect of silybinin on the migration of HepG2 cells. Methods MTT assay was used to determine the effect of silybinin on cell proliferation and viability of HepG2 cells. Cell scratch and Transwell assay were used to evaluate the effect of silybinin on migration of HepG2 cells. mRNA transcription level of Twist, Snail and Slug genes was qualified by real-time quantitative PCR. The viability of HepG2 cells, migration distance, the numbers of migrated cells and gene expression levels of Twist, Snail and Slug were compared among four groups by Oneway ANOVA. P ＜ 0.05 was considered statistically significant. Results MTT assay showed that silybinin（0, 30, 60, 120, 240, 480 μg/ml）treatment could significantly decrease viability of HepG2 cells in dose- and time- dependent manners（P ＜ 0.05）. The migration distances of silybinin group（60, 120 and 240 μg/ml ) were (1.50±0.24) cm（P = 0.046）、(1.20±0.33) cm（P = 0.037）and (1.05±0.24)cm（P = 0.029）respectively. Then, we examined the numbers of migrated cells were 100.00±4.25、30.00±5.34 and 6.00±2.28（P ＜ 0.05）respectively. Gene expression levels of Twist, Snail and Slug were inhibited in HepG2 cells（P ＜ 0.05）. Conclusion Silybinin could inhibit the migration of HepG2 cells.

Silymarin； Liver neoplasms； Cell movement

2016-04-10）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.004

350122 福州，福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院

廖聯(lián)明，Email：llm@fjtcm.edu.cn

陳惠云，王少珍，廖聯(lián)明. 水飛薊賓對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移的作用研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志∶電子版, 2016, 6(6)∶345-350.