余璞龍?；艚瘕埻鯊娎钭园餐踅鹣閯⒕辗遗伺d華龐榮清

·論著·

體外傳代對版納微型豬骨髓間充質(zhì)干細胞綠色熒光蛋白表達的影響

余璞1,3龍海2霍金龍4王強1李自安1王金祥1劉菊芬1潘興華1龐榮清1

目的 通過分離擴增版納微型豬骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）觀察傳代對慢病毒轉(zhuǎn)染的綠色熒光蛋白（GFP）表達的影響。方法 采集4月齡版納微型豬的骨髓，在DMEM/F12培養(yǎng)液中分離間充質(zhì)干細胞（MSCs），并根據(jù)其形態(tài)學(xué)、抗原標志表達和分化潛能給予鑒定。MSCs與GFP慢病毒載體共培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察GFP的表達，流式細胞儀檢測傳代后MSCs GFP表達率的變化。標記后傳代至1、2、3、4代細胞間比較用非參數(shù)檢驗。結(jié)果 采用直接培養(yǎng)骨髓，可以分離到高表達CD13、CD29、CD90、CD105 的MSCs，并可誘導(dǎo)分化為脂肪、骨和軟骨細胞。MSCs與攜帶GFP的慢病毒載體共培養(yǎng)3天即可觀察到GFP的表達，最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI）值為50，最佳共培養(yǎng)時間為6 d。傳代后 MSCs GFP表達率呈下降趨勢[1代轉(zhuǎn)染率（42.3±2.25）％、2代轉(zhuǎn)染率（41.6±2.65）％、3代轉(zhuǎn)染率（41.4±3.75）％和 4 代轉(zhuǎn)染率（38.2± 4.75）％]，但傳至 4 代GFP表達率的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。結(jié)論 采用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液可以從版納微型豬骨髓中分離到MSCs，GFP慢病毒轉(zhuǎn)染是標記MSCs的有效方法，連續(xù)傳代4代不會顯著影響GFP的表達。

豬； 骨髓； 間質(zhì)干細胞； 細胞培養(yǎng)技術(shù)； 生物學(xué)標記

版納微型豬近交系（banna minipig inbred line，BMI）是云南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾養(yǎng)志教授領(lǐng)導(dǎo)的科研小組精心培育的大型哺乳類醫(yī)學(xué)實驗動物，具有遺傳背景清楚、個體相似度高的特點，是十分珍稀的醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗研究模型[1-3]，近交系來源的細胞也是體外實驗研究的珍稀材料。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是常用的種子細胞，追蹤MSCs在體內(nèi)的生存演變規(guī)律一直是再生醫(yī)學(xué)研究的一個重要內(nèi)容[4]。綠色熒光蛋白（green fuorescent protein，GFP）基因轉(zhuǎn)染是標記干細胞的有效方法。研究建立近交系版納微型豬骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）分離培養(yǎng)及GFP標記的技術(shù)方法，觀察標記細胞傳代對GFP表達的影響，目前尚無研究報道，研究結(jié)果將為版納微型豬開展再生醫(yī)學(xué)研究奠定重要的基礎(chǔ)。

材料和方法

一、實驗試劑與動物

攜帶GFP基因的慢病毒載體液（上海吉滿生物科技有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清和0.25％胰蛋白酶（均為以色列BI公司）；流式抗體CD13-FITC、CD29-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC和CD105-FITC（美國Beckman公司）；肝素鈉（華北制藥集團責任有限公司）；成脂、成骨及成軟骨的分化誘導(dǎo)試劑盒（美國Gibco公司）。倒置熒光相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon公司）、流式細胞儀（美國BD公司）。3頭4月齡雄性BMI，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

二、BMSCs的制備與擴增

取4月齡版納微型豬，用3％戊巴比妥鈉10 ml靜脈麻醉后備皮。局部消毒后，在髂后上脊處用骨穿針穿刺，用含有1 ml肝素鈉生理鹽水（1 200 U/ml）的注射器抽取骨髓0.5 ～ 1 ml，把等量含10％胎牛血清的DMEM與骨髓混均勻，以884×g離心5 min，在超凈工作臺內(nèi)將漂浮的脂肪團塊棄去，用含10％胎牛血清的DMEM 20 ml重懸。將混合液吹打均勻后分別接種在4個75 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶為9 ml，再向每個培養(yǎng)瓶補6 ml含10％胎牛血清的DMEM，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。第3天行半量換液，以后每隔3 ～ 4 d更換培養(yǎng)基，當細胞長至80％～ 90％融合時，按1∶ 4的比例進行傳代?！?/p>

三、免疫表型檢測

參照課題組建立的檢測分析方法[5-6]，將第3代BMSCs用0.25％胰蛋白酶液消化，制成1× 106個/ml的細胞懸液，分別加入流式抗體CD29、CD34、CD45、CD90和CD105，避光孵育30 min，離心后用流式細胞儀檢測細胞標志物的表達。

四、分化潛能檢測

1.成脂分化：取第3代細胞按照1×104個/cm2接種到12孔板中靜置培養(yǎng)，當細胞達到100％融合時，棄去10％胎牛血清的DEME/F12培養(yǎng)液，加入成脂分化誘導(dǎo)液進行培養(yǎng)，每隔3天換液。待培養(yǎng)至14 d后，4％多聚甲醛固定后加入紅油O染色。

2.成骨分化：取第3代細胞按照5×103個/cm2接種到12孔板中培養(yǎng)，待細胞至60％融合狀態(tài)時，棄去培養(yǎng)液后，加入成骨誘導(dǎo)液持續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換液。待培養(yǎng)21 d后，4％多聚甲醛固定后加入茜素紅染色。

3.成軟骨分化：收集第3代細胞，調(diào)整密度為1×107個/ml，取5 μl接種至12孔板中，放置于5％ CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 h，緩慢加入預(yù)溫的成軟骨分化培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔3天換液。培養(yǎng)14 d后，4％多聚甲醛固定、石蠟包埋軟骨細胞小球、病理切片，脫蠟后加入阿新藍染色，生物顯微鏡下觀察拍照。

五、BMSCs的GFP轉(zhuǎn)染標記及檢測分析

取第3代BMSCs，用0.25％胰蛋白酶來消化細胞，以884×g，離心5 min，棄去上清液，加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，制成單細胞懸液。將細胞稀釋至5×104個/ml后，接種于24孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)至細胞達到30％～ 50％融合后，分別以0、25、50、100、200、400的轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）加入攜帶GFP的慢病毒載體液0，25，50，100，200，400 μl，48 h后棄去培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗后，加入不含慢病毒的含10％胎牛血清完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后在熒光顯微鏡下觀察且比較不同MOI的細胞綠色熒光的亮度，亮度最強的則為合適GFP病毒轉(zhuǎn)染細胞的合適MOI。

此后每3天換液1次并觀察熒光表達情況，待細胞融合80％以上進行傳代，將傳代后的細胞消化后制成1×106個/ml單細胞懸液，用流式細胞儀檢測傳代細胞GFP的陽性率。

六、統(tǒng)計學(xué)分析方法

結(jié) 果

一、BMSCs的培養(yǎng)和擴增

采用全骨髓培養(yǎng)法，培養(yǎng)4 ～ 5 d后細胞分裂增殖明顯，出現(xiàn)形態(tài)均一的細胞增殖集落，培養(yǎng)至8 ～12 d，80％以上細胞融合（圖1a），加入胰蛋白酶消化后1∶4傳代，傳代細胞呈漩渦狀貼壁生長，典型的成纖維細胞樣形態(tài)（圖1b），分布均勻。

圖1 光鏡下觀察版納微型豬BMSCs形態(tài) （×40）

注：a圖為采用全骨髓培養(yǎng)法，貼壁的BMSCs呈長梭形態(tài)；b圖為加入胰蛋白酶消化后1∶4傳代，豬BMSCs呈漩渦式生長

圖2 版納微型豬BMSCs免疫表型的流式檢測

二、BMSCs的免疫表型檢測

經(jīng)流式細胞儀分析，結(jié)果顯示培養(yǎng)出的細胞高表達CD13、CD29、CD44、CD90、CD105（圖2a～e），低表達或者不表達CD34（圖2f）。

三、BMSCs的分化潛能

成脂分化：細胞成脂分化誘導(dǎo)14 d后，經(jīng)油紅O染色，可見胞漿內(nèi)有紅色脂滴（圖3a）；成骨分化：細胞成骨分化誘導(dǎo)21 d后，鈣質(zhì)結(jié)節(jié)可被茜素紅染成紅色（圖3b）。成軟骨分化：誘導(dǎo)14 ～ 28 d后，石蠟包埋切片，可見軟骨膠原基質(zhì)被阿甲新藍染成藍色（圖3c）。

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)分化結(jié)果(×40)

圖4 熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細胞

四、GFP標記豬BMSCs

分別按0、25、50、100、200、400的MOI加入慢病毒與豬BMSCs共培養(yǎng)，3 d后可在熒光顯微鏡下觀察到MOI為50的轉(zhuǎn)染組GFP表達明顯較多，即綠色熒光亮度較強，MOI為0的對照組沒有觀察到綠色熒光，剩余其他組均較少表達（圖4a、2b～d）；將細胞消化后采用流式細胞技術(shù)檢測熒光強度，發(fā)現(xiàn)6 d后MOI為50的轉(zhuǎn)染組GFP表達達到高峰且此后維持在較高水平，MOI為100和200組的熒光亮度較弱（圖5）。

五、轉(zhuǎn)染GFP后BMSCs的傳代

轉(zhuǎn)染GFP的BMSCs進行傳代，1、2、3、4代后分別經(jīng)流式細胞儀分析后，轉(zhuǎn)染率分別為（42.3± 2.25）％、（41.6±2.65）％、（41.4±3.75）％和（38.2± 4.75）％。將轉(zhuǎn)染率進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染率呈下降趨勢，但無明顯差異（P ＞ 0.05）（圖6）。

圖5 流式細胞儀分析GFP轉(zhuǎn)染后的熒光強度

圖6 GFP轉(zhuǎn)染的BMSCs傳代后的轉(zhuǎn)染率變化分析

討 論

在含有10％胎牛血清的DMEM/F12的培養(yǎng)液中直接培養(yǎng)4月齡版納微型豬少許骨髓8 d，可以在光學(xué)顯微鏡下觀察到呈旋渦狀貼壁生長的成纖維細胞樣細胞，高表達CD13、CD29、CD44、CD90、CD105，并能在體外誘導(dǎo)分化成骨、成脂、成軟骨，根據(jù)MSCs的鑒定標準，可以判斷這些細胞就是版納微型豬BMSCs。前期研究發(fā)現(xiàn)：年輕供體來源的干細胞活性更好，更適于用作再生醫(yī)學(xué)研究的種子細胞[7]。因此，本研究采集4月齡版納微型豬骨髓，便于分離獲取的MSCs用于后續(xù)研究。

建立穩(wěn)定可靠的示蹤方法是追蹤干細胞生存演變的有效手段，是開展干細胞臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究顯示：攜帶GFP的慢病毒液與版納微型豬BMSCs共培養(yǎng)3 d，即可在熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光的存在，表明慢病毒轉(zhuǎn)染的GFP表達效率較高。MOI為50時，MSCs的GFP表達率最高，說明共培養(yǎng)時GFP的加入量不是越多越好，加入太多，比如MOI為200時，可能是因為慢病毒影響了MSCs的增殖生長。共培養(yǎng)6 d后GFP表達率下降，可能是BMSCs融合度過高增長速度減慢。傳代是否對標記信號的表達有影響，是評價干細胞標記技術(shù)的一個重要指標。本研究顯示：GFP標記的版納微型豬BMSCs傳至6代其GFP表達率變化無顯著差異，但顯示有下降趨勢，說明GFP的表達比較穩(wěn)定，傳代對其影響較小。本實驗結(jié)果提示：GFP慢病毒轉(zhuǎn)染標記的版納微型豬MSCs，有可能用于體內(nèi)研究實驗，并可維持GFP表達數(shù)月之久。一種良好的干細胞標記技術(shù)，要求標記效率高，無毒性，標記時間長，便于檢測觀察。超順磁標記法、熒光染料標記法、PCR檢測法、基因標記法都是近年來建立的干細胞標記方法等[8-10]。GFP轉(zhuǎn)基因標記方法操作簡便快捷，標記細胞移植到體內(nèi)后，既可利用熒光顯微鏡直接觀察陽性細胞的存在而進行定性研究，也可運用流式細胞儀檢測陽性細胞的比例而進行定量分析，可見，該方法具有顯著的優(yōu)勢[11]。本研究顯示：細胞傳代后GFP表達率呈現(xiàn)下降趨勢，提示GFP轉(zhuǎn)染標記干細胞可能不適于長期體內(nèi)示蹤研究。將雄性個體來源細胞移植給雌性個體，檢測Y染色體的存在是最可靠的長期體內(nèi)示蹤技術(shù)方法。因此，本研究選擇雄性版納微型豬作為骨髓供體，目的就在于方便獲取的BMSCs用于后續(xù)長期示蹤實驗研究。

本研究從4月齡的BMI骨髓中分離到了MSCs，具有良好的增殖和分化能力，并建立了GFP轉(zhuǎn)基因標記方法，為下一步以BMI為實驗動物開展干細胞體內(nèi)遷移和分化實驗研究奠定了重要基礎(chǔ)，實驗數(shù)據(jù)有助于BMI的開發(fā)應(yīng)用。

1 Qu KX, Wu GS, Gou X, et al. Genetic differentiations between randomly and selectively bred pig populations in Yunnan, China[J]. Dongwuxue Yanjiu, 2011, 32(3)∶255-261.

2 Wei H, Qing Y, Pan W, et al. Comparison of the effciency of Banna miniature inbred pig somatic cell nuclear transfer among different donor cells[J]. PLoS One, 2013, 8(2)∶e57728.

3 成文敏, 潘偉容, 尹俊芳, 等. 版納微型豬近交系基因編碼區(qū)序列擴增及生物信息學(xué)分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2015, 46(10)∶1706-1712.

4 Azevedo CM, Solano de Freitas Souza B, Andrade de Oloveira S, etal. Bone marrow-derived cells migrate to the liver and contribute to the generation of different cell types in chronic Schistosoma mansoni infection[J]. Exp Parasitol, 2015, 159∶29-36.

5 龐榮清, 何潔, 李福兵, 等. 一種簡單的人臍帶間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)方法[J/CD]. 中華細胞與干細胞雜志∶電子版, 2011, 1(2)∶30-33.

6 龐榮清, 何潔, 李瑞生, 等. 食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細胞的分離與鑒定[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 25(4)∶66-69.

7 潘興華, 龐榮清, 張步振, 等. 不同年齡人骨髓間充質(zhì)干細胞體外生長特性分析[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程與臨床, 2006, 10(5)∶275-279.

8 Keighren MA, Flockhart J, Hodson BA, et al. Lessons from mouse chimaera experiments with a reiterated transgene marker∶revised marker criteria and a review of chimaera markers[J]. Transgenic Res, 2015, 24(4)∶665-691.

9 Martínez-López J, Crooke A, Grande S, et al. Real-time PCR quantification of haematopoietic chimerism after transplantation∶a comparison between TaqMan and hybridization probes technologies[J]. Int J Lab Hematol, 2010, 32(1 Pt 1)∶e17-e25.

10 Kim M, Choi B, Joo SY, et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes[J]. Transplant Proc, 2014, 46(4)∶1186-1190.

11 Matsuda S, Shoumura M, Osuga N, et al. Migration and differentiation of GFP-transplanted bone marrow-derived cells into experimentally induced periodontal polyp in mice[J]. Int J Med Sci, 2016, 13(7)∶500-506.

Isolation and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells of Banna inbred minipig in vitro

Yu Pu1,3, Long Hai2, Huo Jinlong4, Wang Qiang1, Li Zi'an1, Wang Jinxiang1, Lui Jufeng1, Pan Xinghua1, Pang Rongqing1.1the Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chendu Military Commend, the Integrated Engineering laboratory of Cell Biological Medicine of State and Regions, The Transfer Medicine Key Laboratory of Cell Therapy Technology of Yunan Province, The Stem Cell Engineering laboratory of Yunan Province, Kunming 650032，China;2Special Branch Consultation of Kunming General Hospital of Chendu Military Commend, Kunming 650032，China;3Kunming Medical University Kunming General Hospital of Chendu Military Commend, Kunming 650500，China;4Yunnan Agricultural University College of Animal Science and Technology, Kunming 650201, China

Pang Rongqing, Email: pangrq2000@aliyun.com

Objective This study was aimed to isolate and culture bone marrow mesenchymal stem cells(MSC) from inbred Banna minipig in vitro. Metheods Bone marrow was aspirated from posterior superior iliac spine of three male Banna minipigs under sterile conditions. Then, primary bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured. Adherent cells were purified and labeled at the fourth generation with fluorescent dyes GFP in vitro as a source of donor cells. Results Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured successfully in vitro using bone marrow adherent separation metheods. Flow cytometry rescults showed that CD13, CD29, CD90, CD105 were all highly expressed in the cells. However, CD34 were not expressed. After passage, theGFP expression decreased slightly(42.3％±2.25％, 41.6％±2.65％, 41.4％±3.75％ and 38.2％± 4.75％for the 1-4 passages respectively, P ＞ 0.05). Conclusion Miniature pig bone marrow MSCs may proliferate in DMEM/F12 medium with 10％ fetal bovine serum, and labeling of MSCs via GFP lentiviral transfection is effective and stable.

Swine； Bone marrowone； Mesenchymal stem cells; Cell culture techniques; Biological markers

2016-08-16）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.007

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點項目（2015FA039）

650032 昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細胞生物治療中心、干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室、云南省干細胞工程實驗室1，特診科2；650500 昆明醫(yī)科大學(xué)成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院3；650201昆明，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院4

龐榮清，Email：pangrq2000@aliyun.com

余璞，龍海，霍金龍，等.體外傳代對版納微型豬骨髓間充質(zhì)干細胞GFP表達的影響[J/CD].中華細胞與干細胞雜志∶電子版, 2016, 6(6)∶ 363-368.