高銘彤，王佳奇，陳凱，李瑩，李婧毓，劉一桐，丁傳波，劉文叢，鄭毅男

(1. 吉林農業(yè)大學 中藥材學院，長春 130118)

精氨酸雙糖苷對脂多糖誘導的巨噬細胞分泌炎癥因子的影響

高銘彤，王佳奇，陳凱，李瑩，李婧毓，劉一桐，丁傳波，劉文叢*，鄭毅男*

(1. 吉林農業(yè)大學 中藥材學院，長春 130118)

為研究精氨酸雙糖苷(AFG)體外的抗炎機制，以脂多糖(LPS)刺激小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)作為炎癥模型，用精氨酸雙糖苷(AFG)的低、中、高(5、10、20 mg/L)三個劑量進行干預后，MTT法測定細胞毒性作用，Griess法測定一氧化氮(NO)生成量，ELISA法檢測細胞上清液中白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及前列腺素E2(PGE2)的分泌量。結果表明：AFG的三個不同劑量對RAW264.7細胞無抑制作用(P>0.05)，各濃度給藥組的NO、IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2含量與LPS刺激模型組相比較都顯著降低(P<0.01)，推想AFG的抗炎活性可能是通過抑制NO和PGE2等炎癥介質釋放，降低IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的含量而發(fā)揮了作用。

精氨酸雙糖苷；小鼠RAW264.7細胞；抗炎活性；炎癥因子

精氨酸雙糖苷(Arginyl-Fructosyl-Glucose，AFG)是鮮人參在加工成紅參時，麥芽糖和精氨酸在加熱的過程中，發(fā)生梅拉德反應形成的一種葡糖胺重排的中間產物[1]。鄭毅男等[2-3]首次發(fā)現并鑒定了其結構為1′-(精氨酸-N2基)-1′-去氧-4′-O(α-D-吡喃葡萄糖基)-D-果糖[4]?，F代藥理研究表明，AFG的藥理活性強，具有抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、對微循環(huán)[7]、免疫調節(jié)[8]等作用，但對抗菌抗炎的作用少有研究。NO、IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2等[9-10]，都是巨噬細胞經過刺激后產生的炎癥因子，而這些炎癥因子的抑制作用通常作為衡量藥物抗炎活性的重要指標[11]。因此，本實驗擬通過脂多糖(LPS)刺激小鼠RAW264.7單核巨噬細胞作為模型，觀察不同濃度的AFG在體外對炎性細胞因子NO，IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2合成和分泌的影響，從而研究精氨酸雙糖苷在體外的抗炎作用。

1 材料

1.1 細胞株來源 小鼠的RAW264.7單核巨噬細胞，購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫

1.2 藥品及試劑 精氨酸雙糖苷AFG，實驗室自制，純度大于90%，臨用時用純凈水配置成高、中、低劑量所需濃度；一氧化氮(NO)測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；白細胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、白細胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒和前列腺E2(PGE2)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，批號：201511，均購于美國R&D公司；小牛血清(FBS)，購于Hyclone公司；脂多糖(LPS)，購于Sigma公司；二甲基噻唑(MTT)，購于Amresco公司；二甲基亞砜(DMSO)，購于Sigma公司；地塞米松(DMX)，購于Sigma公司；青鏈雙抗，購于Gibco公司；蒸餾水，實驗室自制。

1.3 主要儀器 TGL-20B高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；微量振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠；-70℃溫冰箱，Haier；CO2培養(yǎng)箱，Forma Scientific公司，美國；倒置顯微鏡，Olympus公司，日本；電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司，上海；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設備廠；MK3酶標儀，Thermo Electron公司，美國；電熱恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；移液槍，Thermo；48孔細胞板，COSTER；LC-20AT Shimadzus HPLC，檢測器SPD-20A，日本島津公司；FD-1D-50型真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

2 方法

2.1 AFG制備 取L-精氨酸1 g，麥芽糖2 g，檸檬酸0.75 g，溶于10 mL丙三醇中，搖勻，于80 ℃水浴條件下反應120 min,得AFG總合成物，上樣于高效陽離子柱，1.5%氨水洗脫，部分接收器接樣，分批處理后，樣品通過HPLC測得純度，真空冷凍干燥機凍干為白色粉末。將粉末分別配置成5、10和20 mg/L三個濃度，備用。

2.2 細胞培養(yǎng) 使用RPMI1640培養(yǎng)液50 mL培養(yǎng)小鼠巨噬細胞系RAW264.7，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)。2.3 給藥分組 空白對照組：不加藥物干預也不加脂多糖刺激；LPS模型組：不加藥物干預只加10 μg/L的LPS處理，建立炎癥模型；陽性對照組：加地塞米松DMX0.5 μg/L干預后2 h加10 μg/L的LPS刺激；給藥組：加入不同濃度(5、10、20 mg/L)的AFG進行干預后2 h加10 μg/L的LPS刺激。

2.4 檢測方法

2.4.1 對RAW264.7細胞存活率影響 取對數生長期的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成1×105/mL單細胞懸液，以每孔100 μL點在48孔板內，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入不同濃度(5、10、20 mg/L)的AFG預處理2 h后，加入10 μg/L的LPS刺激細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在終止細胞培養(yǎng)前4 h，將上述各處理組的各孔細胞中加入20 μL，5 mg/L的MTT，37 ℃繼續(xù)孵育。終止細胞培養(yǎng)后，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩，直至細胞內結晶完全溶解，530 nm波長下用酶標儀測定各孔吸光度值(OD值)。

2.4.2 對LPS誘導的RAW264.7細胞NO的檢測將調整好的1×105/mL單細胞懸液，在48孔板中每孔均勻點100 μL，根據2.3所述的過程進行分組處理后，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取上清液，按照NO測定試劑盒(Griess法)說明書測定細胞培養(yǎng)液中NO含量。

2.4.3 對LPS誘導的RAW264.7細胞IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2的檢測 取對數生長期細胞，使細胞懸液濃度為1×105/mL每孔100 μL均勻點于48孔板內，與2.4.2操作相同，根據2.3所述的過程進行分組處理后，37 ℃，5% CO2繼續(xù)細胞培養(yǎng)24 h后取上清液，按照ELISA試劑盒說明書上的方法分別檢測IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2的分泌量。

3 結果

3.1 對RAW264.7細胞存活率影響 MTT結果(圖1)顯示，AFG的三個濃度干預細胞24 h后，AFG的三個劑量均與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明AFG對細胞的活性沒有顯著影響。

圖1 AFG三個濃度對RAW264.7細胞活性的影響

與空白組相比##P<0.01；與模型組相比**P<0.01圖2 AFG三個劑量對LPS誘導小鼠細胞NO的生成情況

3.2 NO檢測 NO生成的影響結果見圖2，模型組與空白對照組相比NO的生成量顯著增加，差異

具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。不同劑量的AFG處理組與模型組比較，NO的生成量顯著減少，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，AFG低、中、高三個劑量與模型組相比，NO含量逐漸降低，其低、中、高三個劑量的抑制率分別為22.2%、30.3%和50.6%。3.3 IL-1β、IL-6的檢測 結果見表1。

表1 AFG三個劑量對LPS誘導小鼠細胞IL-1β、IL-6的生成情況

與空白組相比##P<0.01；與模型組相比**P<0.01；與陽性組相比ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

結果顯示，模型組與空白對照組相比，IL-1β和IL-6都有顯著增加(P<0.01)，而經AFG處理后的IL-1β和IL-6的分泌量與模型組相比都顯著降低(P<0.01)，其中，經AFG的低劑量和中劑量處理后的IL-1β分泌量與陽性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AFG的高劑量處理后的IL-1β分泌量與陽性對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。3.4 TNF-α、PGE2的檢測 TNF-α和PGE2的生成情況見表2。模型對照組與空白組比較，TNF-α和PGE2的生成均顯著增加(P<0.01)，AFG給藥組三個劑量與模型組比較，TNF-α和PGE2的生成均顯著性降低(P<0.01)。其中，在TNF-α的生成量中，AFG的低、中、高三個劑量成逐漸降低趨勢，AFG的20 mg/L劑量最有效。經AFG的中劑量和高劑量處理后的PGE2分泌量比AFG低劑量組分泌量低，與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)。

表2 AFG三個劑量對LPS誘導小鼠細胞NF-α、PGE2的生成情況

與空白組相比##P<0.01；與模型組相比**P<0.01；與陽性組相比ΔΔP<0.01

4 討論

NO具有促進炎癥形成和抗炎的雙重特性，既抑制淋巴細胞增殖，又促發(fā)包括類風濕關節(jié)炎在內的許多免疫反應及免疫病理過程[12]。有研究表明，過多的產生NO是有害的，會導致各種炎癥和自發(fā)免疫性疾病[13]。本研究通過細胞培養(yǎng)液中NO的含量檢測發(fā)現，LPS模型組的NO分泌量比空白組明顯升高，而AFG的三個劑量組的NO分泌量與LPS模型組比較均顯著降低，并且隨著藥物濃度的升高，分泌量水平呈逐步降低趨勢，呈劑量依賴性關系，因此我們可推想AFG 的抗炎作用應該與其抑制NO的合成有關系。

IL-1β和IL-6都是由活化的單核-巨噬細胞產生，是一種具有調節(jié)作用的促炎癥因子，可因TNF-α誘導后產生，也可由LPS刺激直接產生，是LPS誘導發(fā)熱的主要內在介質，是炎癥反應的主要誘導者[14]。IL-6可通過自身分泌的形式作用在軟骨細胞，用來促進軟骨細胞的增殖[15]。通過LPS誘導小鼠RAW264.7細胞分泌出大量炎癥因子，與空白對照組有明顯差異，則代表建造炎癥模型成功，對試驗中細胞上清液的IL-1β和IL-6含量檢測發(fā)現，AFG三個劑量組的分泌量與LPS模型組比較均有顯著降低，由此得出抑制IL-1β和IL-6的釋放水平，對于緩解炎癥效果、控制炎癥進程具有重要意義。

TNF-α主要由巨噬細胞產生，也可由LPS是誘導后，T細胞和NK細胞在某些刺激因子作用下分泌產生，是炎癥反應進程中起到最為關鍵的作用，是介導炎癥反應、細胞和腫瘤免疫等病理和生理過程中一種重要的細胞因子，生物學活性廣泛[16]。本研究中給藥組干預后的炎癥因子分泌量與模型組比較均有顯著降低，且分泌量隨給藥濃度逐漸變大而成遞減趨勢，呈劑量依賴性關系。結果表明AFG可以通過對抑制炎癥細胞因子的釋放起到抗炎的作用。

PGE2是一種重要的細胞生長和調節(jié)因子，是花生四烯酸環(huán)氧合酶代謝產物，是前列腺素(PG)的一種，具有免疫抑制和抗炎作用[17]。本研究顯示：AFG三個劑量均明顯抑制了通過用LPS誘導的小鼠RAW264.7單核巨噬細胞后分泌的PGE2，且AFG10 mg/L處理組抑制最明顯。因此可推想AFG的抗炎作用大概與其抑制PGE2的合成相關。

人參是滋補身體的要藥，在醫(yī)療保健上常被人們稱為“長生不老藥”[18-19]。AFG屬于氨基酸衍生物一種，是人參中一種主要成分，人參中還包括人參皂苷、人參多糖、多肽和多糖等其他成分，近幾年人們對AFG 的研究逐漸增加，發(fā)現AFG有很強的藥理活性，既往研究發(fā)現：AFG有抗氧化、抗腫瘤和促進微循環(huán)等藥理活性；本研究結果表明：AFG還有抗炎癥因子的生物活性。

本研究通過LPS刺激小鼠RAW264.7單核巨噬細胞作為模型，體外檢測通過藥物AFG進行干預后的細胞毒性和炎癥因子的分泌情況，結果顯示，經過AFG干預后的炎癥因子(NO、IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2)分泌量與模型組相比較有顯著降低(P<0.01)，且AFG的低、中、高三個劑量對細胞均無毒副作用，但AFG的體外抗炎機制還有待進一步研究。

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(編輯：李文平)

Effects of Arginyl-Fructosyl-Glucose on the Secretion of Inflammatory Cytokines in Macrophages Induced by Lipopolysaccharide

GAO Ming-tong, WANG Jia-qi, CHEN Kai, LI Ying, LI Jing-yu, LIU Yi-tong,DING Chuan-bo, LIU Wen-cong*, ZHENG Yi-nan*

(1.CollegeofChineseMedicinalMaterials，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

In this paper, we studied the anti-inflammatory mechanism of arginyl-fructosyl-glucose (AFG)invitro. The inflammation model, which was established based on the mouse monocyte-macrophage cells (RAW264.7) stimulated by lipopolysaccharide (LPS), is intervened by three doses of AFG, low, medium and high (5, 10, 20 mg/L). After intervention, MTT approach was used to access cytotoxicity; Griess approach is used to determine the amount of nitric oxide(NO); and ELISA was used to evaluate the secretion of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and prostaglandin E2(PGE2) in cell supernatants. The results that: The three doses of AFG have no inhibition effect on RAW264.7 cells (P>0.05). In the control group, all contents of NO, IL-1β, IL-6, TNF-α and PGE2are significant less than placebo group (LPS model) (P<0.01). The mechanism of AFG in anti-inflammatory activity may be contributed by inhibiting the release of inflammatory mediators of NO and PGE2, reducing the amount of IL-1β, IL-6, TNF-α and other inflammatory factors.

arginyl-fructosyl-glucose(AFG); mouse RAW264.7 cells; anti-inflam- matory activity; inflammatory factors.

科技型中小企業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項目(20160308002YY)

2016-08-31

A

1002-1280 (2016) 11-0065-05

Q53